MS-275聯合低劑量順鉑對小鼠肝癌移植瘤生長抑制作用的研究

張海元,許光華,張 靜 (長江大學醫學院,湖北荊州434023)

順鉑 (cisplatin,DDP))是臨床應用最為廣泛的一種抗癌藥物,通過順鉑對腫瘤細胞作用的分子生物學研究顯示,鉑類藥物的主要作用機制是通過損傷DNA,使細胞進入G1期生長抑制,并誘導損傷嚴重的細胞進入凋亡狀態[1]。但順鉑副作用較大,順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴重損害,另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時易引起耐藥性,故臨床上如何減小順鉑的細胞毒性和耐藥性是目前面臨的重要課題。MS-275屬于苯甲酰胺類去乙酰酶 (HDAC)抑制劑,可上調p21基因的表達,對多個小鼠的人腫瘤模型都表現出強烈的抑瘤作用[2]。本課題擬采用低劑量的順鉑和MS-275聯合應用,以探討二者是否具有協同作用,是否能減少肝癌患者順鉑的使用劑量,降低順鉑對患者的毒副作用及耐藥性。通過本項目的實施,有望獲得全新的聯合抗腫瘤藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

H22肝癌細胞株由新加坡國立大學腫瘤研究所饋贈,小鼠腹水傳代。6～8周齡健康小鼠40只,雌雄各半,體質量18～22g。DDP購于錦州九泰藥業公司,MS-275購于德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 無菌操作,取H22小鼠腹水,臺盼藍染色,光鏡下瘤細胞計數,活瘤細胞＞90%,調整細胞濃度為5×106個/ml,分別取0.2ml于右腋皮下注射,制成實體型荷瘤鼠模型,2周后于小鼠右腋皮下形成H22肝癌細胞系移植瘤。

1.2.2 動物分組與治療 40只荷瘤小鼠隨機分成4組,即對照組 (生理鹽水0.2ml)、MS-275組(2mg/kg)、DDP組 (10mg/kg)、聯合治療組 (MS-275+DDP組),每組10只。每組荷瘤小鼠分別進行腹腔內注射,每周2次,共2周。在最后一次注射治療結束后第2周,用頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠,觀察各項指標。

1.2.3 瘤重稱取及腫瘤抑制率的計算 小鼠處死后,分別取出腫瘤瘤體,剝離干凈后,用濾紙擦拭干凈,電子天平稱取瘤重,并按公式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%。

1.2.4 腫瘤組織細胞超微結構的電鏡觀察 切取上述各組小鼠腫瘤組織,分別經40g/L戊二醛及10g/L四氧化鋨預固定和固定后,用乙醇及丙酮逐級脫水,環氧樹脂包埋,制作0.5μ m厚薄切片,醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察。

1.2.5 免疫組化檢測 免疫組化染色采用SP法,參照SP免疫組化試劑盒說明書進行操作。切取小鼠腫瘤組織,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋并切片,檢測移植瘤組織中半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達及微血管密度 (MVD)的測定。在MVD的測定中,用CD31抗體標記微血管。

免疫組化結果判斷:胞漿內棕黃色顆粒為caspase-3、VEGF、CD31陽性表達 (CD31抗體標記血管內皮細胞);微血管密度計算方法:棕黃色血管內皮細胞或細胞族代表一條單獨微血管。

1.3 統計學分析

應用SPSS13.0軟件進行數據處理,采用χ2分析檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 順鉑聯合MS-275對肝癌移植瘤的抑制作用

聯合治療組 (MS-275+DDP)小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質量為(0.96±0.12)g,抑瘤率為66.8%;DDP組移植瘤質量為(1.52±0.19)g;MS-275組移植瘤質量為(1.65±0.25)g,而對照組移植瘤質量為(2.78±0.28)g。治療組與對照組比較具有統計學差異 (P＜0.05),聯合治療組 (MS-275+DDP)與MS-275組或DDP組比較差異具有統計學意義 (P＜0.05)。

2.2 H22移植瘤超微結構的變化

透射電鏡觀察結果顯示,對照組細胞壞死,但部分細胞結構完整,常染色質豐富;MS-275治療組可見部分早期凋亡細胞;順鉑組可見細胞大量壞死,未見明顯細胞凋亡指征;MS-275+順鉑聯合治療組可見凋亡小體,細胞質密度增高,染色質高度凝集固縮。

2.3 免疫組化檢測結果

用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織Caspase-3及VEGF蛋白表達水平,其中細胞漿著色成棕黃色為陽性表現。實驗結果顯示,各治療組與對照組比較及聯合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,Caspase-3蛋白表達均具有統計學差異 (P＜0.05);另外,各治療組與對照組比較,VEGF蛋白表達明顯下調,且均具有統計學差異 (P＜0.05)。用CD31標記微血管密度 (MVD)的表達顯示,治療組與對照組比較及聯合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統計學差異 (P＜0.05)。

表1 各組Caspase、VEG F、CD31(MVD)蛋白表達水平 %

3 討 論

肝細胞癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發生是一個多因素、多階段、多基因變異的積累過程。肝細胞癌的發生、發展不僅存在細胞增殖與分化的異常,也與細胞凋亡異常密切相關[3]。MS-275是一種較新的苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑 (HDACIs),有誘導腫瘤細胞增殖阻滯、分化凋亡以及選擇性地作用腫瘤細胞等抗癌活性。據報道[4-5],MS-275已被證實對白血病和實體瘤進行治療,表現出良好的療效,不良反應的發生率及發生程度均極低,這說明與傳統的化療藥物相比HDACIs具有較大的優勢。本課題組在前期的實驗中證明MS-275在肝癌細胞系Hep3B中能誘導p21WAF1/CIP1表達,加速腫瘤細胞凋亡[6],并對多個小鼠的人腫瘤模型上都表現出強烈的抑瘤作用。Sato等[7]應用MS-275聯合順鉑治療口腔鱗狀細胞癌,證實兩類藥物可通過不同途徑作用于腫瘤細胞,具有協同作用,對化療藥物起到減毒增效的功效。研究表明[8],肝細胞癌的發生發展及細胞凋亡與腫瘤的新生血管生成程度密切相關,血管生成在腫瘤生長和轉移中具有重要意義。腫瘤內血管生成受多種相關基因/蛋白的調控,它們共同調節肝細胞癌的生物學行為,其中血管內皮細胞生成因子在腫瘤血管生成中發揮主要作用。VEGF是由腫瘤細胞分泌,通過與血管內皮上的相應受體結合促進內皮細胞增殖,同時可增加血管通透性使內皮細胞遷移,誘導腫瘤血管生成,維持腫瘤的繼續生長,是目前發現的最強烈的血管生成因子,與諸多生理及病理過程有關。而微血管密度被認為是能反映腫瘤血管生成的一個指標,能反映干細胞癌的侵潤和轉移能力,且與VEGF的表達呈正相關,被認為是一種新的腫瘤生物學特征[9]。故針對癌細胞凋亡或抑制癌內新生血管形成的治療將成為抑制肝細胞癌生長的熱點。

肝細胞癌發生發展過程中微環境的改變可以影響腫瘤細胞的凋亡狀態,是通過激活一系列基因、啟動各種機制而誘導肝癌細胞凋亡,其中Caspase蛋白起著極其重要的作用[10]。本研究通過在小鼠體內移植肝細胞癌,并分別采用化療藥物順鉑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275及聯合用藥 (DDP+MS-275)等方法進行治療,結果顯示,聯合治療組小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質量為(0.96±0.12)g,抑瘤率達到66.8%,與順鉑治療組和MS-275治療組比較差異具有統計學意義,本實驗結果說明化療藥物順鉑和MS-275聯合應用在抑制干細胞癌瘤體生長和增加抑瘤率中都發揮明顯療效,明顯抑制干細胞癌的增殖生長,起到明顯的協同效應。在使用透射電鏡觀察移植瘤超微結構來看,聯合治療組可見凋亡小體,細胞質密度增高,染色質高度凝集固縮,相比于單獨使用順鉑組或MS-275組而言,凋亡特征非常明顯。用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平,發現聯合治療組中Caspase-3表達明顯上調,推測聯合應用順鉑和MS-275治療肝細胞癌移植瘤過程中,通過不同途徑誘導腫瘤細胞凋亡并發揮協同作用可能是實現其對肝癌細胞抑制作用的機制之一。

肝細胞癌是惡性腫瘤,侵潤和轉移是其主要生物學特征,也是影響肝細胞癌患者治療效果和預后的重要因素,而肝細胞癌內新生血管生成在腫瘤生長和轉移中具有重要意義。本研究用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織VEGF蛋白表達水平,實驗結果顯示,各治療組與對照組比較,VEGF蛋白表達明顯下調,且均具有統計學差異。另外,用CD31標記微血管密度 (MVD)的表達顯示,治療組與對照組比較及聯合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統計學差異 (P＜0.05)。本研究結果說明,聯合治療組可通過明顯下調VEGF蛋白表達,減少腫瘤細胞MVD,對小鼠移植肝細胞癌的發生發展有顯著抑制作用。

通過本實驗的研究,聯合應用MS-275及化療藥物順鉑治療小鼠肝細胞癌移植瘤,可能通過不同途徑及機制作用于肝癌細胞,加速腫瘤細胞凋亡,并抑制腫瘤內新生血管形成,控制肝細胞癌的生長、侵潤和轉移,為肝細胞癌的治療提供新的靶點和全新的聯合用藥方案。

[1]Siddik Z H.Cisplatin:mode of cy totoxic action and molecular basis of resistance[J].Lung Cancer,2002,38:217.

[2]Kasman L,Lu P,Voelkel-Johnson C.The histone deacetylase inhibitors depsipeptide and MS-275,enhance T RAIL gene therapy of LNCaP prostate cancer cells without adverse effects in normal prostate epithelial cells[J].Cancer Gene Ther,2007,14(3):327-334.

[3]Haurie V,Mé nard L,Nicou A,et al.Adenosine triphosphatase pontin is overexpressed in hepatocellular carcinoma and co regulated with reptin through a new posttranslational mechanism[J].Hepatology,2009,50(6):1871-1883.

[4]Sakajiri S,Kumagai T,Kawamata N,et al.Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human ly mphoid cancer cell lines[J].Exp Hematol,2005,33(1):53-61.

[5]Garcia-Manero G,Issa J P.Histone deacetylase inhibitors:a review of their clinical status as antineoplastic agents[J].Cancer Invest,2005,23(7):635.

[6]Zhang H Y,Chen P,Bai S,et al.The Histone Deacetylase Inhibitor MS-275 Induces p21WAF1/CIP1 expression in Human Hep3B Hepatoma cells[J].Drug Development Research,2007,68(2):61-70.

[7]Sato T,Suzuki M,Sato Y,et al.Sequence-dependent interaction between cisplatin and histone deacetylase inhibito rs in human oral squamous cell carcinoma cells[J].Int J Oncol,2006,28(5):1233-1241.

[8]Huynh H Y,Ngo V C,Choo S P,et al.Sunitinib(SU TENT,SU11248)suppresses tumor growth and induces apoptosis in xenograft models of human hepatocellular carcinoma[J].Curr Cancer Drug T argets,2009,9(6):738-747.

[9]Aebersold D M,Burri P,Beer K T,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha:a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer[J].Cancer Res,2001,61(7):2911-2916.

[10]Lee J,Lim K T.Apoptotic activity of ethanol ex tract from Styrax Japonica Siebold Zuccarini in HepG2 cells[J].J Ethnopharmacol,2010,131(1):210-215.