α-淀粉酶發酵條件的優化

朱中南 鄭 毅 章淑妹 朱志春

α-淀粉酶發酵條件的優化

朱中南 鄭 毅*章淑妹 朱志春

福建師范大學生命科學學院

利用米曲霉菌株液體發酵生產α-淀粉酶。產酶培養基優化試驗表明：以面粉為碳源，黃豆餅粉為有機氮源，NaNO3為無機氮源。發酵配方如下（g/L）：面粉濃度為45，黃豆餅粉濃度為20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4?7H20 0.01。產酶培養條件優化表明：最適發酵初始pH為7，裝液量為40mL（250mL三角瓶），接種量為10%，發酵溫度為33.5℃，搖床轉速為235rpm，培養時間為72h。此條件下，最終發酵水平達到1962.32U/mL，比初始時提高45%。

米曲霉 α-淀粉酶 單因素實驗

α- 淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍分布在動物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶[1]。它以隨機作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內的α-1，4葡萄糖苷鍵，產生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業生產中應用最為廣泛的酶制劑之一，主要應用于發酵、紡織、飼料、醫藥等多種領域[2]。應用于各種工業中對縮短生產周期、提高產品得率和原料的利用率，提高產品質量和節約糧食資源，都有著極其重要的作用。

目前本實驗室的米曲霉是采用誘變融合得到，其發酵的初始培養基的配方，所產淀粉酶的量還不是很高，通過培養基的優化可以提高酶的產量，同時可以采用更為低廉的天然農產品或工、農業生產廢棄品來替代價格較為昂貴的藥品、材料，以降低成本。本實驗采用單因素法確定米曲霉最適的碳源、氮源、無機鹽、pH值、溫度、接種量、裝液量等，從而得出最優的培養基配方和發酵條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌種

米曲霉()FS0113,本實驗室保藏。

1.1.2培養基

1）斜面培養基（g/L）：蔗糖 30，NaNO32, K2HPO41, MgSO40.05, KCl 0.5,麩皮 0.8，瓊脂 1.2，FeSO4?7H20 0.01。

2）種子培養基（g/L)：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4?7H20 0.01，玉米粉 40，黃豆餅粉 16。

3）發酵初始培養基（g/L）：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4?7H20 0.01，玉米粉 40，黃豆餅粉 16。

1.2 實驗方法

1.2.1酶活測定方法

Yoo改良法[2]：反應體系為5mL 0.5%淀粉+0.5mL酶，在pH6.0、40℃下反應5min后，加0.1mol/L H2SO45mL終止反應，取0.5mL反應液+5mL 0.4mmol/L I2-KI溶液顯色，620nm下測光密度。1個活力單位定義為5min水解1mg淀粉的酶量。

酶活的計算方法：

酶活=（對照組-實驗組）/對照組×淀粉濃度×酶液稀釋倍數

1.2.2米曲霉最初發酵培養條件

在250mL三角瓶液體培養，裝液量為40mL，接種量為4mL，在235rpm、28℃的條件下培養72h。

2 結果與分析

2.1 α-淀粉酶發酵培養基優化

2.1.1不同碳源對發酵產酶的影響

單獨選擇面粉、大米粉、糊精、淀粉、蕎麥、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作為碳源，替代基礎發酵培養基中的玉米粉，其余培養基成分和發酵條件不變。測定酶活結果，由圖1可見，面粉、大米粉、淀粉、蕎麥作為碳源時，都有利于米曲霉產酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖對產酶的促進作用較低。其中面粉對產酶的促進作用最大，因此選擇面粉作為最佳唯一碳源。

2.1.2不同有機氮源對發酵產酶的影響

在以面粉為唯一的碳源的條件下，選擇玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黃豆餅粉作為有機氮源，其余條件不變。測定酶活結果由圖2可看出，牛肉膏作為有機氮源有利于米曲霉產酶，而玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素作為有機氮源時，對產酶的促進作用較低。從工業生產的角度，牛肉膏的成本太高，產酶促進作用只較黃豆餅粉作為有機氮源的高一些，因此選擇黃豆餅粉作為有機氮源。

圖1 不同碳源對產α-淀粉酶的影響

圖2 不同有機氮源對產α-淀粉酶的影響

2.1.3不同無機氮源對發酵產酶的影響

在以面粉和黃豆餅粉的最佳濃度的條件下，選擇NaNO3、NH4NO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4作為附加無機氮源。由圖3表明，NaNO3和KNO3對酶活的促進作用較大，而NH4NO、NH4Cl、（NH4）2SO4的促進作用較小。因此選擇NaNO3作為最佳的無機氮源。

圖3 不同無機氮源對產α-淀粉酶的影響

2.2 α- 淀粉酶發酵培養條件優化

2.2.1不同發酵初始pH值對發酵產酶的影響

通過以上實驗，得出最佳的培養基成分，在基礎上通過改變發酵液的pH值進行發酵。測定酶活由圖4可以得到，當pH值為7，也就是發酵液為中性的情況下，其酶活最高，而偏酸性或者偏堿性都對酶活有一定的抑制作用，隨酸度（堿度）的加強，抑制越明顯。因此發酵過程選擇pH值為7的條件進行發酵。

圖4 pH對產α-淀粉酶的影響

2.2.2不同接種量對發酵產酶的影響

在最佳發酵配方的基礎上，通過對1mL、3mL、4mL、5 mL、7mL、10mL的接種量進行發酵對比。測定酶活如圖5所示，增加接種量，對米曲霉產酶能力的促進作用越大，在達到4mL接種量時，其促進作用最大，繼續增加時，反而會使其產酶能力的促進作用降低。因此選擇4mL的接種量作為最佳的接種量。

圖5 接種量對產α-淀粉酶的影響

2.2.3不同裝液量對發酵產酶的影響

通過對25mL、35mL、40mL、45mL、55mL、70mL的裝液量進行發酵對比。測定酶活如圖6所示，裝液量的變化對于發酵的結果影響不是很大。只有在40mL和55mL裝液量情況下對產酶的促進作用較大一些，出于經濟角度考慮，選擇40mL的裝液量作為最適裝液量。

圖6 裝液量對米曲霉產α-淀粉酶的影響

2.2.4 不同溫度對發酵產酶的影響

以發酵的最佳配方配制培養基，分別在24.5℃、28℃、30℃、33.5℃、37℃、40.5℃、44℃下進行發酵。其結果由圖7可得，溫度升高，其產酶能力也隨之提高，當到達33.5℃時產酶能力最高，繼續升高溫度，產酶能力降低，最后當溫度到達44℃時，產酶能力為0。因此米曲霉的產α-淀粉酶的最適溫度為33.5℃。

3 結論

通過以上優化，發酵前后培養基與培養條件比較見表1。

圖7 溫度對產α-淀粉酶的影響

表1 培養基優化前后α-淀粉酶產量對比

經過培養基與培養條件優化，得出最佳培養基配方（g/L）：面粉45，黃豆餅粉20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4?7H20 0.01。最優培養條件為：初始培養基pH為7，40mL的裝液量，4mL的接種量，溫度為33.5℃、轉數為235rpm。在上述發酵條件下，發酵72h后，測得最高酶活為1962.32 U/mL，而初始發酵的酶活為1365.68 U/mL，提高了45%。

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[2] 王淑軍，陸兆新,秦松，呂明生，李富超，劉紅飛，鄧祥元.超嗜熱古菌耐熱酸性α-淀粉酶的發酵件和酶學性質研究[J].海洋與湖沼，2009，40（1）：19-26.

[3] 安弋，劉新育，蘆鵬，劉亮偉，陳紅.1株酸性α-淀粉酶產生菌的鑒定及發酵條件優化[J]. 安徽農業科學，2010，38( 4) : 1709-1711.

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