載銅納米殼聚糖對斷奶仔豬生長性能、免疫和抗氧化指標的影響

王敏奇 葉珊珊 杜勇杰 陶文靜 謝小利

(浙江大學動物科學學院，動物分子營養學教育部重點實驗室，杭州 310029)

載銅納米殼聚糖對斷奶仔豬生長性能、免疫和抗氧化指標的影響

王敏奇 葉珊珊 杜勇杰 陶文靜 謝小利

(浙江大學動物科學學院，動物分子營養學教育部重點實驗室，杭州 310029)

本試驗旨在研究不同劑量載銅納米殼聚糖(CNP-Cu)對斷奶仔豬生長性能、免疫和抗氧化指標的影響。選擇108頭平均體重(7.20±0.81)kg的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分成6組，每組3個重復，每個重復6頭豬。對照組飼喂基礎飼糧;抗生素組在基礎飼糧中添加100 mg/kg金霉素;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組在基礎飼糧中分別添加50、100、150、200 mg/kg的CNP-Cu。試驗期28 d。飼養試驗結束后，前腔靜脈采血制血清，測定免疫及抗氧化指標。結果表明:1)飼糧中添加CNP-Cu能提高仔豬平均日采食量和平均日增重，降低料重比，降低腹瀉率，以100 mg/kg劑量組的作用效果最佳(P＜0.05);2)飼糧中添加CNP-Cu能顯著提高斷奶仔豬血清補體C3水平、谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力(P＜0.05)。結果提示，飼糧中添加載銅納米殼聚糖能提高斷奶仔豬的免疫和抗氧化機能，提高生長性能，降低腹瀉率，具有替代抗生素的潛在應用價值。

載銅納米殼聚糖;斷奶仔豬;生長性能;免疫;抗氧化指標

仔豬早期隔離斷奶是規模化豬場提高母豬利用率的重要手段之一，但由此產生的“仔豬早期斷奶應激”會導致斷奶仔豬采食量下降，生長遲滯，腹瀉率上升，生產性能大幅下降。為克服仔豬斷奶應激，生產中往往在斷奶仔豬飼料中添加大量抗生素。抗生素產生耐藥性的負面作用早已引起社會廣泛關注。在歐盟全面禁止在飼料中添加抗生素之后，我國對飼料中抗生素的使用也做出了嚴格的規定。研究開發新型安全的抗生素替代品也一直成為動物營養學界的研究熱點之一。殼聚糖(chitosan，CS)是迄今為止惟一發現的陽離子動物纖維和堿性多糖，具有抗菌和提高機體免疫力的重要功能，被認為是一種新型畜禽促生長劑、免疫增強劑、消化道黏膜保護劑和廣譜抗菌劑［1］。本課題組前期研究表明，殼聚糖納米粒徑化后表現出更高的抗菌性能［2］。在此基礎上，本課題組在納米殼聚糖上負載具殺菌功能的銅離子，研制成功了載銅納米殼聚糖復合微粒(copper loaded chitosan nanoparticles，CNP-Cu)。體外研究發現，納米殼聚糖在載銅后，殺菌能力大幅度增強，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度下降了10倍［2］。在大鼠上的研究表明，CNP-Cu可增強大鼠的免疫機能，顯著提高血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 G(IgG)、補體 C3和溶菌酶(LE)水平，改善大鼠生長性能［3］。但有關載銅納米殼聚糖在斷奶仔豬上的應用研究尚未見報道。因此，本研究以自行研制的CNP-Cu為試驗材料，探討其對斷奶仔豬的生長、免疫及抗氧化機能的影響，旨在為飼用抗生素替代品的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

CNP-Cu微粒由本課題組自制，實測平均粒徑為772.4 nm，平均電荷為 63.62 mV，銅含量為1.504%;抗生素為15%的飼用金霉素(CTC)，購自武漢鑫華遠科技發展有限公司。

選擇108頭體況良好，平均體重為(7.20±0.81)kg的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各占1/2。對照組飼喂基礎飼糧;抗生素組在基礎飼糧中添加100 mg/kg的飼用金霉素;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組在基礎飼糧中分別添加50、100、150、200 mg/kg 的 CNP-Cu。基礎飼糧參照NRC(1998)斷奶仔豬營養需要配制成粉狀全價料，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Com position and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 飼養管理及待測指標

試驗仔豬采用分欄群飼，自由采食和飲水，進行常規仔豬免疫程序，飼養管理按常規進行。試驗前對豬舍常規進行消毒。預試期5 d，正試期28 d。試驗期間每天記錄飼料消耗量及腹瀉狀況。試驗結束后，禁飼24 h后稱重。計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)及腹瀉率(diarrhoea rate)。

1.3 樣品采集與保存

試驗結束當天08:00，所有參試豬前腔靜脈采血約 10 m L，3 000 r/m in離心 15 m in取血清，－70℃保存。采血前1天20:00停喂飼糧，使仔豬空腹12 h。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血清免疫指標測定

血清 IgG、IgA、免疫球蛋白 M(IgM)，補體C3、C4的測定采用免疫濁度法，試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司，在RX daytonaTM全自動生化分析儀上測定;LE的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒。

1.4.2 血清抗氧化指標測定

血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒。

1.5 數據處理與分析

所有試驗數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，采用Duncan氏多重比較進行組間差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 生長性能與腹瀉率

由表2可見，斷奶仔豬飼糧中添加不同劑量CNP-Cu均不同程度地改善了豬的生產性能，其中以100 mg/kg劑量組效果最佳，ADG、ADFI分別較對照組提高了 82.24%和29.76%(P＜0.05)，F/G 下降了28.82%(P＜0.05)，該組仔豬生產性能整體水平優于金霉素組，但未達顯著水平(P＞0.05)。50 mg/kg劑量組豬的生產性能也有較好表現，ADG、ADFI分別較對照組提高了72.97%和27.04%(P＜0.05)，F/G 下降了 26.39%(P＜0.05)，與 金 霉 素 組 相 當。150 mg/kg 和200 mg/kg劑量組仔豬生產性能較對照組亦有改善，但低于50 mg/kg和100 mg/kg劑量組及金霉素組。結果可見，CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能的改善無劑量線性相關，本梯度試驗表明，100 mg/kg為最佳劑量組。

斷奶仔豬飼糧中添加不同劑量CNP-Cu具有不同程度的抗腹瀉效果，以100 mg/kg劑量組最佳，仔豬腹瀉率較對照組下降了29.84%(P＜0.05)，與金霉素組相當。

表2 CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響Table 2 Effect of CNP-Cu on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets

2.2 血清免疫指標

由表3可見，飼糧中添加不同劑量CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫球蛋白有不同程度的提高，但未達到顯著水平(P＞0.05)。此外，50、100和150 mg/kg劑量組血清補體C3水平分別較對照組提高了 42.86%、57.14% 和42.86%(P＜ 0.05)。血清LE含量以100 mg/kg劑量組最高，較對照組提高了 28.70%(P＜0.05)。

表3 CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫指標的影響Table 3 Effect of CNP-Cu on serum immune indices of weaned piglets

2.3 血清抗氧化指標

由表4可見，飼糧中添加CNP-Cu均不同程度地提高了血清中 GSH-Px的活性，50、100、150和200 mg/kg劑量組分別較對照組提高了10.26%(P＜ 0.05)、7.12%(P＜ 0.05)、5.51%(P＞0.05)和8.55%(P＜0.05)。與對照組相比，50、100、150和200 mg/kg劑量組血清T-AOC分別提高了27.07%、33.70%、28.18% 和 24.31%(P＜0.05)。各組間SOD、CAT和POD活性未發現有顯著差異(P＞0.05)。

表4 CNP－Cu對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響Table 4 Effect of CNP-Cu on serum antioxidant indices of weaned piglets

3 討論

3.1 CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

Braude［4］首次發現飼糧中添加動物正常需要量10倍的銅，可明顯提高動物的生長性能。銅離子已被證實具有體內抗菌的作用，銅離子復合體具有母體配體與無機銅離子所沒有的顯著藥理學效應。研究發現，有機銅源(蛋氨酸銅、賴氨酸銅、酪蛋白銅等)的作用效果明顯優于無機銅源(硫酸銅、氧化銅等)［5－8］。殼聚糖是迄今為止惟一發現的堿性多糖，在其復雜的空間結構中含有高活性的功能基團，表現出類抗生素的特性，能夠抑制多種細菌的生長。殼聚糖納米化后由于納米粒子的特性而表現出更高的殺菌活性［9］。CNP-Cu是以殼聚糖和CuSO4為主要原料，運用納米技術構建的可降解、無毒無害的聚合物，具有粒徑小、表面電荷高等納米粒子特殊的生物學特性，能夠提高其在生物陽離子環境中的穩定性，并通過與負電性生物膜的互作和體內特異位點靶向作用提高其殺菌活性［2］。本試驗結果顯示，添加不同劑量CNP-Cu能提高斷奶仔豬的 ADG、ADFI和 F/G，其中100 mg/kg劑量組的作用效果最顯著。與抗生素金霉素組相比，添加100 mg/kg的CNP-Cu組在提高生長性能方面的效果也具一定優勢，但差異未達到顯著水平。這與課題組前期在大鼠上的研究相一致，與對照組相比，每天分別口服80和160 mg/kg BW的CNP-Cu能顯著提高大鼠的ADG和 F/G［3］。劑量梯度飼養試驗還發現，CNP-Cu對斷奶仔豬生長性能的改善不存在劑量線性相關性，高劑量添加未出現生產性能的進一步的改善。這與常規殼聚糖在動物上應用的效果基本一致。目前，較多報道表明殼聚糖具有提高動物生長性能的作用［10－13］，但推薦的適宜添加量不同，總體表現為低劑量促生長而高劑量抑制生長。有關CNP-Cu的最適添加量及高劑量抑制生長的機理還有待進一步深入研究。

仔豬早期斷奶易發生腹瀉，飼糧中抗生素的使用能明顯降低斷奶仔豬的腹瀉率［14－15］。本試驗結果表明，飼糧中添加100 mg/kg的金霉素能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率。添加不同劑量的CNP-Cu也能顯著降低仔豬腹瀉率，效果略低于抗生素組，但差異不顯著。CNP-Cu具有很高的電動電位，更容易與帶負電的菌體表面發生作用，因此表現出較高的殺菌活性，并通過破壞菌體細胞膜導致菌體內物質外泄而死亡［16］。前期對大鼠的研究表明，CNP-Cu有效抑制了腸道病原菌的生長和繁殖，降低了細菌酶活性，從而改善了腸黏膜形態結構和功能，有助于養分的充分消化和吸收利用［16］。這一點很好地解釋了本試驗中CNP-Cu能顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率的作用機理，揭示CNP-Cu具備替代抗生素的巨大潛力。

3.2 CNP-Cu對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

哺乳動物體內起免疫保護作用的主要是IgG、IgA和IgM 3種免疫球蛋白。補體具有協助、補充和加強抗體及吞噬細胞免疫活性的作用，在機體防御體系中起到協同抗感染的作用。LE能溶解細菌細胞壁，也能使病毒失活，還參與機體多種免疫反應，是反映巨噬細胞功能的標志酶，是細胞免疫能力高低的一項重要指標。本課題組前期對大鼠的研究發現，CNP-Cu能顯著提高大鼠血清中IgA、IgG和LE的水平，補體C3的濃度也高于對照組，其作用效果優于殼聚糖［16］。本試驗中未發現添加CNP-Cu對血清中3種免疫球蛋白含量產生顯著影響，但血清補體C3和LE含量均顯著高于對照組，尤以100 mg/kg劑量組效果最佳。研究認為，納米微粒容易被人或動物的免疫系統識別并通過胃腸道淋巴結吸收，同時，納米微粒還可延長免疫反應的時間，并誘發機體產生體液和細胞免疫反應［17］。

3.3 CNP-Cu對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響

動物在應激狀態下，機體抗氧化酶活性降低，消除氧化代謝產物的能力下降，從而導致體內自由基產生與清除的動態平衡被打破，自由基逐漸積累并產生氧化損傷。SOD、GSH-Px、CAT、POD等具有很強的清除活性氧和自由基的作用，可提高機體的抗氧化能力，是常用的抗氧化指標［18］。本試驗發現，飼糧中添加不同劑量CNP-Cu均顯著提高了血清GSH-Px活性和T-AOC。說明飼糧中添加CNP-Cu可改善斷奶仔豬抗氧化能力，緩解應激造成的自由基對機體生物膜的破壞，從而提高機體免疫力和抗病能力。

4 結論

① CNP-Cu能顯著提高斷奶仔豬的生產性能，降低腹瀉率，以100 mg/kg劑量組效果最佳。

② CNP-Cu可顯著提高血清補體C3水平、GSH-Px活性及T-AOC。

③斷奶仔豬飼糧中添加CNP-Cu能提高機體免疫力，增強抗氧化能力，從而產生抗斷奶應激，改善生產性能的效果。

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Author，WANG Minqi，associate professor，E-mail:wangmq@zju.edu.cn

(編輯 武海龍)

Chitosan Nanoparticles Loaded Copper Ions A ffect G row th Performance，Imm unity and Antioxidant Indices of Weaned Piglets

WANG Minqi YE Shanshan DU Yongjie TAO Wenjing XIE Xiaoli
(College of Animal Science，Zhejiang University;Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition of Ministry of Education，Hangzhou310029，China)

The study was conducted to investigate the effect of dietary chitosan nanopartides loaded copper(CNP-Cu)on growth performance，immunity and antioxidant indices of weaned piglets.A total of 108 21-day-old threeway cross(Duroc×Landrace×Yorkshine)weaned pigletswith an initial average body weight of(7.20 ±0.81)kg were random ly assigned into 6 groupswith 3 replicates per group and 6 piglets per replicate.The piglets in control group were fed basal diet;Piglets in chlortetracycline(CTC)group were fed the basal diet supplemented with 100 mg/kg CTC，and piglets in four trial groups(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ)were fed the basal diet supplemented with 50，100，150 and 200 mg/kg CNP-Cu，respectively.The experiment lasted for 28 days.A fter term ination of the feeding trial，blood sampleswere collected from anterior vena cava of all piglets for serum indices analysis.The results showed as follows:1)supplementation of CNP-Cu increased average daily feed intake and average daily gain，and decreased feed gain ratio and diarrhea rate，and the optimal supplemental level of CNP-Cu was 100 mg/kg(P＜0.05).2)Serum complement component3，glutathione peroxidase activity and total antioxidant capacity were significantly increased with the supplementation of CNP-Cu(P＜0.05).These results suggest that supplemental CNP-Cu has beneficial effects on immune and antioxidant function in weaned pigs，which also can increase growth performance and decrease diarrhea rate.Accordingly，CNP-Cu has a potential to substitute antibiotics.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1806-1811］

CNP-Cu;weaned pigs;growth performance;immune;antioxidant

S828

A

1006-267X(2011)10-1806-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.022

2011－04－13

浙江省重大科技專項(2008C12048)

王敏奇(1972—)，男，浙江安吉人，博士，副研究員，主要從事動物營養與飼料科學研究。E-mail:wangmq@zju.edu.cn