負壓封閉引流技術對兔外周血炎癥因子的影響

楊 帆，胡 耑，白祥軍，李 波，李仁杰，張 錕，薛晨晨

負壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術是一種負壓創面治療的物理方式，經過10余年的應用和推廣，已經在創面修復方面取得了巨大的成功［1－3］。同時我們在臨床上發現VSD還可以降低患者全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥(sepsis)的“二次打擊”［4－5］。白細胞計數(white blood cell，WBC)和C反應蛋白(C reactive protein，CRP)能夠有效監測炎癥反應和感染發生;而腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)則是炎癥網絡中的核心代表。本實驗通過前瞻性對照研究，觀察VSD技術對兔創傷模型外周血WBC、CRP、TNF-α和IL-6的影響，探討VSD技術對感染、炎癥的影響并探討其可能機制。

材料與方法

1 實驗動物

12只普通級健康日本大耳白兔，體質量2.5～3.5 kg，雌雄不限，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物質量合格證號SCXK(鄂)-2008-0005-0007101。

2 動物建模和分組

8%硫化鈉于兔背部脫毛并適應性喂養1周后稱重，氯胺酮30mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，兔背部脫毛區消毒，全層切開皮膚直至肌肉層，形成2cm×2cm的創面，壓迫止血。

12只建模后實驗兔隨機分為:(1)常規組6只，創面每日行常規換藥;(2)負壓組6只，創面行VSD手術后持續以－193.75mmHg(25.8kPa)的負壓吸引，如VSD有漏氣和敷料堵塞，則及時更換。設定建模前12只實驗兔為正常對照，檢測各兔外周靜脈血中WBC計數、CRP、TNF-α和IL-6的正常含量。

上述實驗兔均在特制單籠條件中進行飼養，有效避免創面污染和貼膜破損漏氣。一旦實驗過程中出現標本溶血、凝固則立即重新采集，若實驗兔死亡，則重新入組新實驗兔進行補充實驗。

3 主要儀器、材料和試劑

3.1 儀器:便攜式負壓吸引儀(武漢維斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自動血細胞分析儀(美國Abbott公司)、Aeroset全自動生化分析儀(美國Abbott公司)、BNⅡ特種蛋白分析儀(德國Siemens公司)、Labofuge 400R臺式冷凍離心機(德國Heraeus公司)、Denley dragon wellscan MK3酶標儀和Ascent software for multiskan分析軟件(芬蘭Thermo公司)。

3.2 材料:VSD一次性使用負壓引流護創材料(武漢維斯第公司)、特制飼養籠(武漢同濟醫院)。

3.3 試劑:CRP檢測試劑盒(美國Dade behring公司)、TNF-α檢測ELISA試劑盒(北京博奧森公司)、IL-6檢測ELISA試劑盒(北京博奧森公司)。

4 標本的采集和測定

4.1 WBC血液標本:負壓組和常規組于建模后7天內各時間點(6、12小時、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，注入血常規試管，4℃保存，60分鐘內送檢。應用Cell-PYN Sapphire全自動血細胞分析儀自動進行兔外周靜脈血中WBC計數。

4.2 CRP血液標本:負壓組和常規組于建模后7天內各時間點(6、12小時、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，4℃、3 000rpm離心5分鐘取上清，4℃保存，60分鐘內送檢。采用動態定時散射比濁法，應用BNⅡ特種蛋白分析儀及CRP試劑盒自動檢測兔外周靜脈血中CRP含量。

4.3 TNF-α和IL-6血液標本:負壓組和常規組于建模后7天內各時間點(6、12小時、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，4℃、3 000rpm離心5分鐘取上清，－80℃冷凍保存待測，避免反復凍融。以ELISA法檢測，采用北京博奧森公司TNF-α和IL-6檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明操作。

同時以建模前兔外周靜脈血為對照(0秒)，同上操作采集和測定相關標本。

5 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件，WBC計數、CRP、TNF-α和IL-6的含量均用均數±標準差(±s)表示，計量資料的比較采用t檢驗分析，P＜0.05作為具有統計學意義的標準。

結 果

1 負壓組和常規組外周靜脈血WBC計數和CRP含量的變化(見表1)

由表1可知，建模前兩組外周血WBC計數和CRP含量無顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。自6小時時間點起負壓組的外周血WBC計數和CRP含量較常規組顯著性降低，且具有統計學意義(P＜0.05)。

2 負壓組和常規組外周靜脈血TNF-α和IL-6含量的變化(見表2)

由表2可知，建模前外周靜脈血TNF-α和IL-6含量無顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。建模后兩組TNF-α和IL-6含量均開始增高。自1天時間點起負壓組的外周靜脈血TNF-α含量較常規組顯著性降低，且具有統計學意義(P＜0.01)。自6小時時間點起負壓組的外周靜脈血IL-6含量較常規組顯著性降低，且具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 外周靜脈血WBC計數和CRP含量的變化(n=6)

表2 外周靜脈血TNF-α和IL-6含量的變化(n=6)

討 論

嚴重創傷患者由于病程中經歷創傷和失控性炎癥的雙重打擊［6］，易導致炎癥遞質的異常表達和發生序貫性的多器官功能障礙綜合征(MODS)，臨床上治療極其棘手，很大一部分患者死于繼發的多臟器衰竭(MOF)，成為復蘇后期的主要死因。我們在臨床上觀察到，VSD技術不僅有助于促進肉芽組織和創面生長，而且可以顯著降低SIRS、膿毒癥和MODS的發生率，這可能同局部負壓治療參與全身炎癥因子信號的調控相關［7］。我們通過觀察WBC和CRP作為VSD術后感染指標，TNF-α和IL-6在外周血中含量的變化，研究VSD技術對感染和炎癥的干預效果并探討其可能機制。

1 白細胞計數和C反應蛋白

當機體遭受創傷或者細菌入侵后，以中性粒細胞為首的WBC群，通過細胞吞噬與增強炎癥反應，共同消滅細菌，預防感染，是一種非特異性免疫的直接效應細胞。活化的WBC還可以通過釋放炎癥介質、增加血管通透性、產生趨化作用等參加局部的炎癥反應。

CRP是在IL-6等細胞因子調節下，主要由肝臟合成分泌的一種蛋白質，也可由炎癥局部的巨噬細胞少量產生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增強白細胞的吞噬能力、增強淋巴細胞活性、激活補體等作用。大量研究表明，但當機體存在創傷、感染、急性炎癥等應激情況時，CRP是急性時相蛋白(acute phase protein，APP)中變化最敏感的一種，也是目前評價炎癥和感染程度最為敏感的指標［8］。

我們的研究表明，自建模后6小時起負壓組的外周血WBC計數和CRP含量較常規組顯著性降低(P＜0.05)。這可能同以下機制相關［9］:(1)貼膜可將創面與外界隔絕，以防止清創后的創面進一步被污染，減少創面細菌附著數量，預防感染發生;(2)持續負壓吸引可清除創面壞死物質和滲出液，以及其中的細菌，直接減少創面細菌數量和細菌培養基，從而避免感染發生和WBC升高;(3)及時清除富含炎癥遞質的滲出液和壞死物，亦可降低CRP的反應性分泌。

2 TNF-α和IL-6

炎癥遞質通過相互調節形成復雜的網絡系統，TNF-α和IL-6是共同參與創傷后機體炎癥反應的主要細胞因子。適當的炎癥反應可以將細胞因子水平維持在適當的水平，有利于細胞免疫和機體恢復;如果過度釋放和調節失控，則會誘發SIRS。所以有效調控這些炎癥細胞因子含量，是控制全身失控性炎癥反應和預防MODS的關鍵［10］。

我們的研究表明，建模前外周靜脈血TNF-α含量非常低，一旦發生創傷應激，TNF-α的含量迅速升高，12小時即達到基礎值的6～7倍，隨后迅速下降，1天后各時相點上，兩組比較其差異有統計學意義(P＜0.01)。這可能與TNF-α作為啟動因子，在創傷后炎癥反應早期(12小時內)受創面大小和血管內皮損傷程度的直接調控;在無干預措施的對照組，炎癥反應持續時間長，各種炎癥遞質互相作用，即開始產生“瀑布樣”效應，刺激TNF-α等炎癥因子迅速、大量釋放;相反，負壓組由于VSD持續清除創面富含炎癥因子的壞死物質和滲出液，切斷了TNF-α進一步放大的通路，迅速下調TNF-α及其含量，控制了炎癥反應持續發展。而外周靜脈血IL-6含量變化，在建模前兩組含量相近，但自6小時時相點起負壓組的外周靜脈血IL-6含量較常規組顯著降低(P＜0.05)。可能機制有:IL-6受到機體應激和炎癥因子雙重調控，雖然在早期(12小時內)兩組的TNF-α含量無顯著性差異，但是應激狀態已經開始發生變化，負壓組刺激源強度下調，導致建模后IL-6含量也持續較常規組減低。

綜上所述，WBC、CRP、TNF-α和IL-6不僅是感染和炎癥反應程度的重要評估指標，而且由于之間互相作用和調控，共同參與了感染和炎癥反應的全過程，可能在SIRS、膿毒癥和MODS的發生發展中起著重要作用。而VSD技術能夠在創傷早期通過清除病因，以削弱應激源的放大作用，避免了失控性炎癥反應和MODS的發生，有利于創面的愈合。

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