低分子右旋糖酐與地塞米松預防脂肪栓塞綜合征的實驗研究

蔡賢華，吳璐鋒，劉曦明，徐 峰，黃衛兵，汪國棟，魏世俊

骨折并發脂肪栓塞綜合征(fat embolism syndrome，FES)的救治相當困難，目前尚未取得明顯突破，預防一直是FES研究的重點，藥物逐漸成為預防FES的重要措施之一［1－4］。在早期固定骨折的基礎上，單一藥物(如地塞米松等)已顯示出一定的預防效果［1－5］，但FES仍有一定的發生率，說明FES發病機制的復雜性。而低分子右旋糖酐加地塞米松聯合應用臨床觀察顯示其預防FES的療效較兩藥單用強［5］，但無相關的動物實驗證實。因此，本研究以靜脈注射油酸法建立大鼠FES動物模型，觀察低分子右旋糖酐、地塞米松及其聯用對FES的預防效果，旨在探討這些藥物預防FES的作用及其機制，為臨床應用提供理論依據。

材料與方法

1 材料

健康雄性Wistar大鼠(廣州軍區武漢總醫院實驗中心提供)，體重300～320g。油酸注射液(國藥集團化學試劑有限公司)，低分子右旋糖酐(武漢濱湖雙鶴藥業)，地塞米松(湖北天藥藥業股份有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNFα)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測試盒(南京建成生物工程研究所)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

2 實驗方法

大鼠80只，飼養2周后，隨機分為4組:低分子右旋糖酐組(A組)、地塞米松組(B組)、地塞米松及低分子右旋糖酐聯用組(C組)、空白對照組(D組)，每組20只。

采用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后，經大鼠尾靜脈分別注射相應藥物:低分子右旋糖酐20ml/kg加油酸0.2ml/kg(A組)、地塞米松35mg/kg加油酸0.2ml/kg(B組)、低分子右旋糖酐20ml/kg加地塞米松25mg/kg加油酸0.2ml/kg(C組)、油酸0.2ml/kg(D組)。于注射后1、2、3、4小時隨機取5只大鼠行動脈血氧分壓(PaO2)測定，然后放血法處死大鼠，取肺組織進行相關檢測。

3 PaO2檢查

于注射前及注射后各時間點，經頸動脈抽取血液0.3ml，立即行PaO2測定。

4 MPO、TNF-α測定

于各時間點取肺組織，用等滲鹽水為遞質制成20%勻漿，隨機分為兩部分。一部分按MPO測試盒說明操作，在460nm處，10mm光徑，測各管吸光度值;另一部分4 000r/min離心10分鐘(4℃)，取上清液按TNF-αELISA試劑盒說明操作，在450nm處測定光密度值，通過標準曲線計算TNF-α生成量。

5 組織學檢查

于4小時取肺組織分別行光鏡和電鏡觀察。光鏡標本用10%甲醛浸泡，逐級脫水，石蠟包埋，HE染色。透射電鏡標本則用3%戊二醛前固定24小時以上，1%鋨酸后固定，脫水后樹脂包埋，橫斷面超薄切片，鈾-鉛復染色。

6 統計學分析

結 果

1 一般情況

各組大鼠尾靜脈注射油酸及相應藥物后，均表現為心跳加快、呼吸急促，以D組最明顯，但無死亡。

2 PaO2檢查結果

藥物注射前大鼠PaO2為(12.67±0.58)kPa，注射后PaO2均為C組＞B組＞A組＞D組(圖1)，組間差異具有統計學意義(F=41.076，P＜0.01)。其中，注射1小時時各組均下降:D組最明顯(下降近1/2)，A組次之，C組最輕;隨后PaO2均呈進行性上升:C組2小時、B組3小時、A組4小時接近或超過注射前水平，但D組PaO2上升緩慢且4小時時仍低于A組1小時水平。

3 TNF-α檢查結果

注射后1～4小時均為D組＞A組＞B組＞C組(圖2)，4組之間差異均有統計學意義(F=50.074，P＜0.01;F=46.388，P＜0.01;F=67.575，P＜0.01;F=73.879，P＜0.01)。其中，注射后1、2小時，各組TNF-α值先逐漸上升，隨后呈下降趨勢，4小時時TNF-α含量均低于初始值。

4 MPO檢查結果

注射后各用藥組肺組織MPO值低于空白對照組:D組＞A組＞B組＞C組(圖3)，4組之間的差異具有統計學意義(F=13.257，P＜0.01;F=23.716，P＜0.01;F=6.204，P＜0.01;F=73.285，P＜0.01)。其中，注射1、2、3小時時，各組MPO值基本上呈逐漸上升趨勢，4小時時下降。

5 組織學改變

光鏡觀察各組均有廣泛肺泡間質水腫與肺泡腔滲出，以D組最為嚴重，A、B組有不同程度減輕，C組最輕(圖4)。電鏡檢查見A組、B組肺泡Ⅱ型細胞內線粒體均呈不同程度腫脹，肺泡腔內散見油酸滴，并見白細胞、纖維素滲出;C組Ⅱ型細胞內板層小體良好，肺泡腔內可見單核細胞及紅細胞滲出;D組Ⅱ型細胞退變，胞漿內板層小體破裂，肺泡腔內可見較多巨噬細胞及纖維素等滲出(圖5)。

圖1 各組PaO2水平隨時間變化

圖2 各組TNF-α`隨時間的變化趨勢

圖3 各組MPO隨時間的變化趨勢

圖4 各組肺組織光鏡下改變

圖5 各組肺組織電鏡下改變

討 論

1 油酸靜脈注射制作FES動物模型的特點

靜脈注射油酸、甘油三油酸酯、骨髓脂肪均可制作FES動物模型［1，6］。由于肺血管栓塞或血管內皮細胞損傷，動物注射后出現呼吸急促、心動過速、PaO2下降;病理學檢查呈現肺泡內滲出，肺間質充血、水腫或壞死及炎性細胞浸潤等化學性肺部炎癥改變［6－8］，這些表現與FES相似。骨髓脂肪制作的模型與臨床最為接近，但小型動物不易提取。油酸所致模型優點是簡單易得，模型穩定且重復性強，成本低;缺點是油酸劑量與注射速度不易掌握，劑量偏小或速度過慢PaO2下降不明顯，劑量偏大或速度過快容易死亡，不利于長時間觀察。精確控制油酸劑量與注射速度，可顯著提高造模的成功率與可行性，此方法已廣泛用于FES、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷等研究［6－8］。故本實驗選用油酸靜脈注射法制備動物模型。

FES的病變主要在肺，臨床表現以低氧血癥為主。注射油酸前PaO2為(12.67±0.58)kPa、注射油酸后1小時時PaO2降為(6.43±0.57)kPa，說明PaO2變化明顯。筆者結合人類FES診斷標準［2，5，8］，以PaO2≤8kPa為大鼠FES低氧血癥的判斷標準。當油酸靜脈注射劑量為0.2ml/kg時，大鼠PaO2下降能達到此標準。本實驗靜脈注射油酸后大鼠表現為呼吸、心跳加快、PaO2下降;病理切片示大鼠肺組織表現出廣泛出血，肺葉梗死(圖4、5)，這表明FES模型制作是成功的。

2 地塞米松與低分子右旋糖酐對FES的預防作用與機制探討

PaO2是早期診斷FES的可靠且敏感指標之一，也是肺組織損傷時肺部病理改變的直接反應，阻止PaO2降低、減輕肺組織損傷是FES預防中的關鍵措施［9］。本實驗顯示，使用藥物初期能不同程度地減輕油酸注射所引起的PaO2下降，且隨著時間的推移，各用藥組PaO2逐漸上升，其作用:C組＞B組＞A組。這表明地塞米松、低分子右旋糖酐均能降低FES低氧血癥發生的風險或程度，聯合用藥作用最強，地塞米松次之。組織學檢查結果與之相對應，即各用藥組均能明顯降低FES引起的肺部病理改變(圖4、5):聯合用藥＞地塞米松＞低分子右旋糖酐。可能的原因是各用藥組能不同程度地抑制或降低對肺泡Ⅱ型細胞損害，減輕肺泡壁水腫與肺泡腔滲出。此結果與文獻報道類似［1－5］。

TNF-α、MPO主要分別由巨噬細胞及中性粒細胞分泌。TNF-α在油酸所致肺損傷中是一個前炎性遞質［9］，能誘導中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等分泌具有趨化中性粒細胞功能的白細胞介素-8(IL-8)，中性粒細胞被激活后脫顆粒、釋放溶酶體，導致MPO峰值出現，產生過多的氧自由基;同時它介導肺毛細血管內皮細胞的損害，增加其通透性，并刺激內皮細胞釋放大量組織因子，損害毛細血管的抗凝功能，導致微血栓的形成，從而引起急性肺水腫［3，9－10］。因此，肺組織中TNF-α、MPO的變化能在一定程度上反映FES的嚴重程度及其發病機制。本實驗中各組TNF-α于2小時達到高峰，與文獻報道相似［9］。各用藥組TNF-α水平較空白對照組低(D組＞A組＞B組＞C組)，隨時間延長而作用更明顯(圖2)。除峰值延緩1小時外，MPO水平的變化與TNF－α相似。這些現象與同時相PaO2和肺組織病理改變呈對應關系，表明各用藥組均具有預防FES作用(聯合用藥＞地塞米松＞低分子右旋糖酐)，其主要機制可能是穩定巨噬細胞和中性粒細胞細胞膜，從而減少其相應細胞因子的生成。此外，地塞米松還能阻止炎癥應答反應并抑制血小板聚集［3］，低分子右旋糖酐能減輕肺內紅細胞聚集，改善微循環［5，9］。

綜上所述，地塞米松、低分子右旋糖酐均具有一定的預防大鼠FES作用，聯合用藥作用最強，地塞米松次之。其機制較為復雜，聯合用藥可能是同時阻斷了FES發生的多個病理環節，包括穩定巨噬細胞和中性粒細胞等細胞膜、抑制對肺泡Ⅱ型細胞損害并減少肺組織TNF-α與MPO生成或改善肺內微循環等。

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