自體外周血干細胞與骨基質明膠復合移植治療骨缺損

張小舟,鄒三明,馮華明,黃篤,康照利

(華中科技大學同濟醫學院附屬孝感醫院,湖北孝感 432000)

節段性骨缺損的治療在臨床骨科領域存在很大的困難。我們采用自體外周血干細胞(autologous peripheral blood stem cell,APBSC)與表面脫鈣骨基質明膠 (bone matrix gelatin,BMG)共移植修復節段性骨缺損進行了臨床研究,在課題研究中進行了X線檢查,效果理想,達到了預期目的,在臨床有廣闊的應用前景,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2003年 12月至 2007年 12月我課題組共收治節段性骨缺損病例 36例(骨缺損長度選定為 6～12cm),男24例,女12例;平均年齡39歲(20～65歲)。其中,骨盆骨缺損3例,肱骨骨缺損9例,尺橈骨骨缺損 5例,股骨骨缺損 12例,脛腓骨骨缺損7例。骨腫瘤25例,骨折后骨不連 11例。

依據同種病情、患者自愿的原則,采用納入法將 36例患者隨機分為兩組(即 A組和 B組)。

1.2 APBSC的采集[1]及手術方法 患者入院后在常規術前檢查和治療原發病的基礎上,手術前6d給予分泌型重組人粒細胞刺激因子,600 μg/d皮下注射,連用5 d。手術當日經美國Baxter公司生產的 CS3000PLUS血細胞分離機,分離出外周血干細胞懸液 50mL,采集后干細胞不做任何處理留置備用(外周血干細胞采集工作在孝感市中心血站實驗室完成)。

根據患者骨缺損病變部位,采用相應的手術麻醉和手術切口,充分顯露骨缺損部位,徹底清理骨缺損部位的軟組織和病變骨組織。疏通上下髓腔,將骨斷端修理成梯形以便充分嵌合,清洗術野。

根據骨缺損長度制備相應的 BM G(課題組所用 BM G均由醫院指定的山西組織骨庫制備、提供),將外周血干細胞懸液種入制備好的BMG中。A組患者將APBSC/BM G復合體充分嵌合于骨斷端,B組患者僅使用 BMG嵌合于骨斷端,根據骨缺損部位選擇相應的鋼板、螺釘或交鎖髓內釘進行牢固內固定。

術野放置引流管,依次縫合各層組織,術畢。術后24h拔引流管,抗生素術后使用1周,術后 2周切口拆線。

2 結 果

2.1 影像學觀察 術后1個月復查X線片顯示：A組患者骨折端有骨痂形成;B組患者骨折端骨痂形成不明顯,兩組患者骨折處皆有壓痛。2個月復查X線片顯示：A組患者可見骨折端有大量骨痂形成,骨折處壓痛不明顯,此時開始功能鍛煉;B組患者骨折端有骨痂形成,骨折處壓痛較前減輕。3個月復查 X線片顯示：A組患者可見骨折端有連續骨痂形成,骨折處無壓痛;B組患者骨折端有大量骨痂形成,骨折處有輕微壓痛。

2.2 愈合時間比較 平均愈合時間 A組為 5個月,B組為 8個月,兩組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。在治療期間,患者未見感染及其他并發癥,隨訪12個月均未發生再骨折。

2.3 功能評估 術后結果評定根據國際保肢學會功能評分標準[2]評定 ,術后依疼痛程度、功能活動、心理接受程度、是否用外部支持、行走能力和步態6個指標評價效果。每個指標分0、1、2、3、4、5分,共6級。總分30分,大于 24分為優,18～24分為良,小于15分為差。A組優 16例,良 2例;B組優14例,良4例,兩組間差異沒有統計學意義。

3 討 論

3.1 APBSC/BM G移植理論基礎 骨組織的再生要求有 3個基本的生物學因素參與,即細胞,生長調節因子,細胞外支架材料。種子細胞(成骨細胞)：理想的骨組織工程種子細胞應具備下列特點,即取材容易,對機體損傷小;在體外培養中易定向分化為成骨細胞和具有較強的傳代繁殖能力;植入機體后能適應受區的環境并保持成骨的活性。目前發現種子細胞有以下幾種來源,即胚胎骨、骨外膜、骨髓、骨外組織(包括外周血干細胞)。其中,外周血干細胞具有很強的傳代繁殖和定向分化為成骨細胞的能力,植入機體后能適應受區的環境,保持成骨活性。生長調節因子：主要是生長因子和細胞因子,在組織工程中,某些種子細胞在體外傳代培養后,經過一段時間細胞極易衰老,而生長因子能調節種子細胞的增殖和分化。對成骨細胞起著重要調節作用的生長因子有轉化生長因子β、胰島素樣生長因子、骨形成蛋白、堿性成纖維細胞生長因子及血小板衍生生長因子等。細胞外支架材料：理想的組織細胞外基質材料必須具有如下特征,即良好的生物相容性,良好的生物降解性,具有三維立體多孔結構,良好的可塑性和一定的機械強度,良好的材料-細胞界面,材料須易于消毒。用于組織工程的支架材料有天然和人工合成兩類,目前用于細胞支架材料的主要有聚乳酸、聚羥基乙酸及表面脫鈣骨基質明膠。它們突出的優點是：生物相容性良好,降解速度可調,降解產物易于代謝和排除,以及材料易于消毒等。

干細胞又稱為多潛能干細胞,主要來源于胚胎時期的卵黃囊,為骨髓的原始細胞。既往用于移植的干細胞主要采自骨髓,因此稱為骨髓移植。然而隨著血液學研究的進一步深入,有研究發現[3]干細胞不僅存在骨髓中,同時也存在于臍帶血、胚胎肝臟及外周血中,骨髓移植這一較為片面的概念逐漸被干細胞移植所替代。APBSC來源于骨髓,與骨髓干細胞具有共同的生物學特征,既不斷地自我更新,在造血組織中維持一定數量的能力,又有分化為骨髓紅細胞系、粒細胞系、淋巴細胞系以及巨核細胞系的潛力[4]。有研究表明[5]外周血細胞的不同階段,包括干細胞、前祖細胞及晚祖細胞,均有 CD34+細胞膜分化抗原,然而定向祖細胞卻沒有這種抗原,由此外周血干細胞可以由 CD34+細胞代表。正常情況下,外周血細胞中只有(0.2±0.1)%的 CD34+細胞[6],表明外周血中干細胞數量極低,遠不能滿足臨床應用的需要。增加移植所需要外周血干細胞數的主要方法包括[1]：a)骨髓抑制性化療藥;b)造血因子：其中粒細胞集落刺激因子最常用; c)前兩種聯合應用,以上方法可使外周血干細胞增加數十倍,甚至數百倍。本課題組根據課題研究條件選擇粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員。目前從外周循環血中直接分離外周血干細胞的難度較高,本實驗利用干細胞的大小與淋巴細胞接近的形態學特點,用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞或單個核細胞,從而提取移植所需要的外周血干細胞[5,7]。

Chalmers等[8]提出骨形態蛋白、間充質細胞、骨生長環境是誘導成骨的三個關鍵要素,骨形態蛋白作為誘導刺激物作用于間充質細胞,在有利于骨生長的血液環境中,誘導刺激骨形成。 BM G含有骨形態蛋白,其由同種異體骨經過脫脂、表面脫鈣、脫蛋白、脫細胞處理等處理后,去掉了除骨形態蛋白以外 95%的非膠原蛋白和具有阻滯作用的脂質成分[9]。有實驗研究表明[10],BM G移植在短期(6～9周 )可以產生較大的骨誘導作用。BM G[11]的特點：既有強度又有孔隙;其免疫原性低,生物相容性好;與外周血干細胞及軟骨細胞復合后具有較好的兼容性;能在體內逐漸吸收,被新骨所替代;來源廣泛。因此,逐漸成為臨床上常用的骨移植材料[12,13]。 BM G不用與任何移植材料的空白對照組比較,其療效已被大量文獻報告[14-16]所肯定。

骨折愈合是建立骨的連續性和恢復骨的生物學特性。APBSC/BMG復合移植治療骨缺損,既利用了外周循環血中的多潛能干細胞,保留骨的生物學特性;又利用了 BM G中的骨形態蛋白,從而誘導成骨細胞形成[17,18]。APBSC在 BM G的骨形態蛋白誘導下具有明顯的成骨作用。與單純 BM G移植相比較,APBSC/BM G復合移植具有新骨形成時間更短、新骨形成質量更好的優點。

我們認為 APBSC/BMG復合移植具有廣泛的臨床應用前景,理由是：a)APBSC/BM G復合移植避免了傳統手術中自體采骨給患者帶來的痛苦以及供區新的骨缺損等一系列并發癥,對機體創傷減小到最低限度,移植物處理達到幾乎無創傷[14]。b)使骨缺損修復的手術難度降低。c)與同種異體骨或異種骨移植相比較,免疫排斥反應極小;與人工骨比較, BMG同時具有良好的生物相容性、生物降解性能,在體內吸收被新骨所替代[16,19]。d)BM G可塑形,APBSC/BMG復合移植不僅在骨科,還可廣泛應用于頜面外科及整形外科。

3.2 異體骨的應用及內固定的選擇 自體骨移植是臨床常用的修復骨缺損的方法。自體骨移植無免疫排斥反應,骨誘導作用好。若受床血供良好,有健康的軟組織覆蓋,則骨愈合快,效果令人滿意。但骨源有限,并且會對供體造成新的缺損,而且人工替代物尚不適用于大段骨移植[20]。同種異體骨移植已有百年歷史,近年骨庫的發展使供體的選擇、制備、滅菌和保存方法更加規范、嚴格。異體骨植骨量充足,形態可按需選擇。另外,本組病例中我們采用了鋼板、螺釘和牢固的絞鎖髓內釘內固定,這些固定對于早期的異體骨愈合能起到較好作用。

3.3 骨缺損長度的選擇 課題組選擇的病例骨缺損長度為6～12 cm,因為骨缺損在6cm以下可以通過截取自體髂骨填充缺損段達到較好骨愈合;對于12cm以上的缺損,血管化植骨優于游離植骨。所以兩組病例我們都選擇骨缺損長度為 6～12 cm具有可比性[21]。

3.4 APBSC/BMG臨床應用前景 APBSC/BM G具有諸多優點,如 APBSC/BM G復合移植對機體的創傷大大減少,避免了傳統手術中取自體骨給患者帶來的巨大痛苦,也可減少供區產生新的骨缺損等一系列并發癥;此方法使治療骨缺損的難度降低;APBSC/BM G免疫排斥反應小,具有較好的生物相容性,可在體內吸收被新骨所取代;與商品化的人工骨相比,APBSC/BM G所需費用不高;另外,BMG具有可塑性,APBSC/BM G也可廣泛應用于整形外科等領域。因此APBSC/BMG復合移植具有廣泛的臨床應用前景。

3.5 并發癥 a)應用大塊同種異體骨移植后的最主要并發癥是排異反應繼發的感染、骨不連、異體骨骨折等。本組 36例未見嚴重的排異反應繼發的感染、骨不連、異體骨骨折。這種現象應與良好的固定保證了移植區域的穩定有關。b)在外周血干細胞動員時觀察有無骨痛、乏力、皮疹、發熱、胃腸道反應(惡心、嘔吐、便秘)。c)在外周血干細胞分離及采集過程中觀察有無低鈣性口周麻木、抽搐,迷走神經反應性面色蒼白,低血容量性面色蒼白、暈厥[22]。d)腫瘤患者 APBSC移植后腫瘤可能復發。

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