衣霉素對RPMI-8226細胞分化的影響

譚建軍，林 榮，侯俊丞，董浦江

(1.川北醫學院附屬三臺醫院血液內科，四川三臺 621100;2.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶市普外科學重點實驗室，重慶 400016)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是起源于B細胞的惡性腫瘤。好發于中老年人，以骨痛為主要臨床表現［1］。誘導分化治療多發性骨髓瘤是一新的治療領域。衣霉素(tunicqamycin，TM)是一核苷抗生素，它可通過抑制蛋白糖基化途徑中的十四糖二磷酸長萜醇的生成，形成脫糖蛋白，阻礙內質網內新生蛋白質糖基化修飾，內質網中鈣離子紊亂和未折疊蛋白蓄積，引起具有保護作用的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)發生［2］。UPR在具有分泌抗體的細胞分化中有著重要作用。本實驗在重慶醫科大學附屬第一醫院重慶市普外科學重點實驗室完成，我們以小劑量TM誘導RPMI-8226細胞，探討TM在誘導分化治療多發性骨髓瘤中的機理，為臨床應用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鼠抗人XBP-1u蛋白抗體、兔抗人CD49e抗體、兔抗人β-actin蛋白抗體(美國Santa cruz公司)，衣霉素(美國sigma公司)，測定免疫球蛋白輕鏈ELIAS試劑盒(美國GE公司)，APAAP試劑盒(醫學科學院生物制劑中心)，電泳試劑盒(武漢博士得公司)，發光試劑盒(美國GE公司)，蛋白提取液(武漢博士得公司)，圖像分析系統(美國BID-RAD公司Chemi DOCXRS)。

1.2 RPMI-8226細胞

為多發性骨髓瘤細胞株，購自中國醫科院細胞庫。用含10%FBS的1640培養液在37℃、5%CO2培養箱培養，成對數生長期時用于實驗。實驗組加TM，其終濃度0.4μmol/L，分別繼續培養48小時與72小時。對照組加TM溶劑。

1.3 RPMI-8226細胞CD49e表達率測定

2%胰酶消化實驗組及對照組細胞，將細胞滴加在多聚賴氨酸打底的載玻片上，推片，涼干后，CD49e抗體1∶100稀釋，具體按APAAP試劑盒說明書進行操作，每張玻片在200倍光鏡下，計數上、下、左、右四個區域，100個細胞中呈棕色之細胞數，一式三份。

1.4 RPMI-8226細胞培養液中免疫球蛋白測定

12000r/min離心收集上述實驗及對照組細胞培養液，按ELIAS試劑盒說明書進行測定，一式三份。

1.5 XBP-1u蛋白表達測定

用細胞刮刮取上述實驗組與對照組的RPMI-8226細胞，置EP管內，震蕩混勻后置4℃、30分鐘，取勻漿置離心管中12000r/min離心20分鐘。取上清液測定蛋白含量，爾后用蛋白提取液將蛋白濃度均調至3mg/ml。將該組織液經100g/L SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，電轉于PVDF膜，50g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉，經一抗及二抗孵育后，化學發光法顯色，圖像分析系統拍攝并用Quantity One軟件將特異條帶灰度數字化。

XBP-1u表達水平的相對值(XBP-1u蛋白表達系數)為XBP-1u蛋白條帶灰度與內參蛋白β-actin蛋白條帶灰度比值。(XBP-1u蛋白表達系數=XBP-1u蛋白積分光密度/β-actin蛋白積分光密度)。

1.6 統計學處理

實驗數據采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，實驗結果采用均數±標準差(x－±s)描述，三組資料各指標的比較采用單因素方差分析，兩輛比較采用SNK法。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RPMI-8226細胞CD49e表達率

對照組細胞CD49e表達率為7.8% ±2.3%，衣霉素處理48小時實驗組CD49e表達率為25.3%±3.1%，衣霉素處理72小時實驗組CD49e表達率為43.6% ±3.3%，對照組與兩實驗組有顯著差異(p＜0.01)。

2.2 RPMI-8226細胞培養液中免疫球蛋白:

對照組培養上清液免疫球蛋白輕鏈含量為(182±25)mg/L，衣霉素處理48小時實驗組為(311±19)mg/L，衣霉素處理72小時實驗組為(405±23)mg/L。對照與兩實驗組差異均有顯著性(p＜0.01)。

2.3 XBP－1u蛋白表達

對照組、衣霉素處理48小時、72小時實驗組XBP-1u蛋白表達，見圖1。對照組XBP-1u蛋白表達系數為0.16±0.10，衣霉素處理48小時實驗組XBP-1u蛋白表達系數為0.53±0.17，衣霉素處理72小時實驗組 XBP-1u蛋白表達系數為0.93±0.15。對照與兩實驗組差異均有顯著性(p＜0.01)。

3 討論

多發性骨髓瘤是骨髓內漿細胞異常增生的一種惡性腫瘤，目前鮮有有效的治療手段［3］。尋找安全有效的誘導分化治療多發性骨髓瘤具有重要的臨床意義。真核細胞的內質網承擔著新生蛋白質的折疊、組裝和運轉，某些疾病時會產生未折疊或錯誤折疊蛋白，人類和小鼠細胞內存在一種機制，即通過調整內質網折疊蛋白的數量與加強折疊能力緩解內質網壓力，該機制即UPR，UPR可用于保持內質網內穩定和阻止細胞凋亡，這機制可能是多種疾病的病原學基礎［4］。有文獻報道UPR在分泌抗體的細胞(如漿細胞)分化中起重要作用［5］。X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)作為一個轉錄因子參與 UPR的調節［6］。XBP-1s與 XBP-1u分別是XBP-1的剪切體與未剪切體，分別由376及260個氨基酸組成。有研究者［7］發現XBP-1s在骨髓瘤原代細胞中較正常漿細胞表達高，并在轉基因小鼠的實驗模型中發現XBP-1s可促進小鼠骨髓瘤的發病，故認為XBP-1s與骨髓瘤的發病相關。作者用衣霉素處理 RPMI-8226細胞后，RPMI-8226細胞的CD49e陽性率增加，其培養液中的免疫球蛋白輕鏈含量增高，且該現象隨處理時間延長而更明顯。CD49e陽性的骨髓瘤細胞是成熟細胞，能分泌更多的免疫球蛋白。該現象說明RPMI-8226細胞經小劑量衣霉素處理后，向成熟階段分化。同時處理后的RPMI-8226細胞XBP-1u蛋白表達增高，XBP-1u可激活哺乳動物體內UPR，在UPR中起反饋調節，與細胞的分化相關［8］，顯示該細胞向成熟階段分化與XBP-1u蛋白表達增高引發UPR相關。綜上所述，用小劑量的UPR誘導劑－衣霉素可使RPMI-8226細胞RPMI-8226細胞的XBP-1u蛋白表達增高，從而誘導該細胞向成熟細胞轉化。

針對UPR途徑靶向治療多發性骨髓瘤是一新的治療途徑［9］。本實驗結果亦顯示該方法具有應用前景。

［1］ 溫琥玲，謝建平.多發性骨髓瘤及其骨痛的治療［J］.川北醫學院學報，2009，24(2):182 －186

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［4］ Yoshida H，Matsui T，Hosokawa N，et al.A time－dependent phase shift in the mammalian an unfolded protein response［J］.Dev Cell，2003，4(2):265 －271

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［9］ 袁振剛，侯 健.未折疊蛋白反應與多發性骨髓瘤的治療［J］.中華血液學雜志，2007，(28):715 －717