液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中5種多肽類抗生素

摘 要 建立了牛奶中桿菌肽、粘桿菌素A、粘桿菌素B、維吉尼霉素和萬(wàn)古霉素5種多肽類抗生素的反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。牛奶樣品經(jīng)甲醇-0.1%甲酸水提取后，用4%三氯乙酸乙腈除蛋白，液-液萃取后，采用0.1%甲酸 （A）和0.1%甲酸乙腈（B）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，質(zhì)譜（ESI＋）采用多離子檢測(cè)模式（MRM）對(duì)兩價(jià)態(tài)或三價(jià)態(tài)的定性和定量離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，5種多肽類抗生素在25， 50和100

@ g/kg的添加水平的回收率為75.1%～120.1%; 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.7%；方法檢出限為0.2～5.6

@ g/kg。本方法前處理操作快速簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，滿足對(duì)牛奶中多肽類抗生素的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求，適合大量樣品的準(zhǔn)確定性和定量分析。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 牛奶； 多肽； 殘留

1 引 言

多肽類抗生素是由不同類型的氨基酸縮合而成的小分子肽類，主要用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及治療畜禽疾病。目前，多肽類抗生素被廣泛用于家禽、豬、牛等飼料添加劑和獸藥。常用的多肽類抗生素包括粘桿菌素、桿菌肽、維吉尼霉素及萬(wàn)古霉素等。然而，隨著多肽類抗生素的廣泛使用，濫用及不遵守休藥期等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。藥物將可能通過(guò)食物鏈的傳遞進(jìn)入人體，危害人體健康。如果長(zhǎng)期暴露，還會(huì)增加細(xì)菌的抗藥性，具有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

多肽類抗生素可分別抗革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌、真菌、病毒、螺旋體、原蟲的感染，特別是對(duì)牛乳腺炎等疾病有較好的療效。目前，歐盟、日本、美國(guó)、澳大利亞等均已制定牛奶中多種多肽類抗生素的限量。其中，歐盟對(duì)桿菌肽A及粘桿菌素的限量分別為100和50

@ g/kg；日本對(duì)桿菌肽A、維吉尼霉素、萬(wàn)古霉素、粘桿菌素的限量分別為400，100，10和10

@ g/kg。而我國(guó)也于近年制定了牛奶中桿菌肽A及粘桿菌素的限量，分別為500和50

@ g/kg。關(guān)于多肽類抗生素的檢測(cè)方法逐漸引起了關(guān)注。

目前，多肽類抗生素檢測(cè)方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳法等，但這些方法均存在靈敏度低等問(wèn)題，無(wú)法滿足粘桿菌素的50

@ g/kg的檢出限要求。有關(guān)同時(shí)檢測(cè)這5種多肽的研究尚未見報(bào)道。近年來(lái)，HPLC-MS/MS檢測(cè)方法在痕量分析中的應(yīng)用廣泛，已有用HPLC-MS/MS檢測(cè)多肽的報(bào)道。但該方法前處理方法復(fù)雜，檢出限仍無(wú)法滿足現(xiàn)有國(guó)際限量的要求。本實(shí)驗(yàn)采用快速前處理步驟，同時(shí)檢測(cè)牛奶中5種多肽類抗生素，方法簡(jiǎn)單、實(shí)用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）； API5000串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）； 十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）； 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）； Waters Sunfine C18色譜柱（50 mm×2.11 mm， 5

@ m， 美國(guó)Agilent公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）； N-EVAPTM111氮吹儀（美國(guó)OA公司）； KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（中國(guó)昆山市超聲儀器公司）。乙腈和甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher 科技公司）； 其它試劑為分析純（上海試劑廠）； 水為MilliQ超純水。維吉尼霉素純度95%、桿菌肽純度92%、粘桿菌素純度99%、萬(wàn)古霉素純度95%（Sigma 公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取桿菌肽、粘桿菌素、萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g （精確至0.000001 g），用0.1%甲酸溶解并定容至100 mL；稱取維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g （精確至0.000001 g），用甲醇溶解并定容至100 mL，制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在4 ℃下背光儲(chǔ)存。根據(jù)需要，用乙腈-0.2%甲酸（1∶9，V/V） 溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，即用即配。

2.2.2 樣品前處理 取2 mL牛奶，加入10 mL甲醇-水-甲酸（28∶72∶0.1，V/V）提取液，1 mL 4% 三氯乙酸乙腈溶液，渦旋3 min，超聲5 min，4 ℃下以10000 r/min離心，取上清液，氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈-0.2%甲酸溶液（1∶9， V/V）溶解。加入5 mL正己烷，渦旋混勻，以10000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，重復(fù)1次，將下層溶液過(guò)0.22

@ m濾膜后移入進(jìn)樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

分 析 化 學(xué)第39卷

第5期劉佳佳等： 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中5種多肽類抗生素

2.2.3 色譜-質(zhì)譜條件 采用Waters Sunfine C18色譜柱（50 mm×2.11 mm， 5

@ m）；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣體積 5

@ L。流動(dòng)相為含0.1% （V/V）甲酸的乙腈溶液（A）和含0.1% （V/V）甲酸-水溶液（B），流速為0.20 mL/min，梯度洗脫：0～3 min， 85%～60% A; 3～5 min， 60%～50% A; 5～14 min， 50%～10% A; 14～18 min， 10%～85% A; 18～25 min， 85% A。

電離方式：電噴霧；離子源溫度：550 ℃；霧化氣：30 L/h，輔助氣：40 L/h，氣簾氣：15 L/h，入口電壓：10 V，出口電壓：13 V；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，各種多肽類抗生素的采集參數(shù)見表1。

3 結(jié)果和討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 

5種多肽類抗生素（萬(wàn)古霉素、粘桿菌素B、粘桿菌素A、桿菌肽A和維吉尼霉素M1）是由氨基酸縮合而成的肽類物質(zhì)，分子量從525到1448。在進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，容易與一個(gè)或多個(gè)H＋結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的單電荷或多電荷離子。維吉尼霉素是分子量最小的多肽類抗生素，分子量525，與H＋ 結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰m/z 526。而萬(wàn)古霉素、粘桿菌素B、粘桿菌素A和桿菌肽A的分子量均超過(guò)1000，在進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，能產(chǎn)生不同豐度的雙電荷離子和三電荷離子。選擇豐度最大的雙電荷離子（\\2＋） m/z 712.2和725.0分別作為桿菌肽A和萬(wàn)古霉素的母離子。而對(duì)于粘桿菌素B和粘桿菌素A，本研究分別比較了在0.1%甲酸水溶液中雙電荷離子m/z 586、578和三電荷離子m/z 391.0、386.0的響應(yīng)值。三電荷離子（\\3＋）的豐度大于雙電荷離子（\\2＋），所以本研究選擇豐度最大的三電荷離子m/z 386.0和391.0分別作為粘桿菌素B素和粘桿菌素A的母離子。

\\n＋離子作為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同碎片離子。如圖1a所示， \\＋作為維吉尼霉素的母離子產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 337.2及355.0離子碎片，其中m/z 337.2豐度最高，作為定量離子。\\2＋作為桿菌肽A的母離子產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 199.2，253.4，356.2等子離子，選擇豐度最大的m/z 356.2作為定量離子。其斷裂的機(jī)理如圖1b所示。與之類似，萬(wàn)古霉素的雙電荷離子作為母離子產(chǎn)生碎片離子m/z 100.3，144.2等子離子，質(zhì)譜圖和斷裂方式如圖1c所示，選擇豐度最大的m/z 144.2作為定量離子。粘桿菌素A和粘桿菌素B分子量以三電荷離子m/z 391.0和386.0 為母離子。但是由于加上3個(gè)質(zhì)子后，化合物裂解產(chǎn)生改變，粘桿菌素A和粘桿菌素B的二級(jí)離子質(zhì)譜圖見圖1d和1e。

圖1 5種多肽類抗生素的二級(jí)質(zhì)譜圖

Fig．1 Product ion spectra of five peptides antibiotics

a． 維吉尼霉素（Virginiamycin）; b． 桿菌肽A（Bacitracin A）; c． 萬(wàn)古霉素（Vancomycin）; d． 粘菌素A（Colistin A）; e． 粘菌素B（Colistin B）。

3.2 色譜條件的選擇

由于多肽類抗生素本身帶有較多的氨基和羧基，對(duì)pH值有嚴(yán)格的要求。實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%乙酸溶液-乙腈、5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸溶液-乙腈對(duì)離子化的影響。結(jié)果表明，0.1%甲酸-乙腈體系能使多肽類在質(zhì)譜中有最好的響應(yīng)值，這是由于甲酸可以為陽(yáng)離子的形成提供必需的質(zhì)子來(lái)源，從而提高其離子化效率，因此選用甲酸作為酸度調(diào)節(jié)劑。但是0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，粘桿菌素A色譜峰拖尾嚴(yán)重，如圖2a所示。由圖2b可見，在0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈體系下，甲酸可以使色譜柱內(nèi)硅膠硅醇基質(zhì)子化，從而減弱硅醇基與多肽藥物之間的相互作用，使得色譜峰型尖銳，且拖尾現(xiàn)象減少。此外，由于多肽本身不穩(wěn)定，在40 ℃以上很可能會(huì)部分分解，而當(dāng)柱溫低時(shí)流動(dòng)相粘度大，目標(biāo)物質(zhì)出峰慢、色譜柱的理論塔板數(shù)低，因此柱溫選為30 ℃。

3.3 樣品前處理的優(yōu)化

多肽類物質(zhì)溶解性差別較大，桿菌肽、粘桿菌素和萬(wàn)古霉素易溶于水，微溶于甲醇等有機(jī)試劑。但是維吉尼霉素易溶于甲醇，因此在提取過(guò)程中使用含不同配比0.1%甲酸和甲醇作為提取液。添加濃度在100

@ g/kg下，對(duì)比了體積比為5∶5，6∶4，7∶3，8∶2的水-甲醇作為提取液的效果，結(jié)果見圖3。 水-甲醇（7∶3， V/V）的提取效果最好，可達(dá)到80%以上。在此基礎(chǔ)上對(duì)提取液的配比進(jìn)行了微調(diào)，比較了70∶30， 72∶28，74∶26和72∶28（V/V）的水-甲醇提取液對(duì)4類多肽類抗生素的提取效果，結(jié)果表明， 水-甲醇（72∶28， V/V）水-甲醇的提取效果最好。因此，本研究的提取液選擇水-甲醇（72∶28， V/V）。

 圖2 不同流動(dòng)相條件下的粘桿菌素A色譜峰型比較；（a） 0.1%甲酸-乙腈；（b） 0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈

Fig．2 Comparison of chromatographic peak of colistin A; （a） 0.1% formic acid in water-acetonitrile; （b） 0.1% formic acid in water-0.1% formic acid in acetonitrile

圖3 不同配比提取液的回收率

Fig．3 Comparison of recovery data of extraction solution with different proportions

1. 維吉尼霉素（Virginiamycin）; 2. 桿菌肽A（Bacitracin A）; 3. 粘桿菌素A＋B（Colistin A＋B）; 4. 萬(wàn)古霉素（Vancomycin）\\.

實(shí)驗(yàn)表明，4%，6%和8%（V/V）的三氯乙酸-乙腈溶液除蛋白的效果差別不顯著。雖然部分物質(zhì)存在干擾，但是在提取離子流圖中不影響多肽類物質(zhì)的定性和定量分析。但是8%三氯乙酸-乙腈溶液導(dǎo)致5種多肽類物質(zhì)特別是粘桿菌素A和粘桿菌素B的峰型變化較大，而4%三氯乙酸-乙腈溶液對(duì)峰型的影響較小。因此，本研究選用4%三氯乙酸-乙腈溶液作為除蛋白溶劑。

采用正己烷除去牛奶中的脂肪類雜質(zhì)，對(duì)比5 mL正己烷除脂兩次和10 mL正己烷除脂一次的效果發(fā)現(xiàn)，5 mL正己烷除脂兩次的效果好。 圖4 牛奶中5種多肽的選擇離子流圖

Fig．4 Selective ion chromatograms of 5 kinds of polypeptides in milk圖4為100

@ g/kg桿菌肽、粘桿菌素、萬(wàn)古霉素和25

@ g/kg 維吉尼霉素的標(biāo)準(zhǔn)添加色譜圖。



3.4 多肽類抗生素的穩(wěn)定性

由于多肽類抗生素還有多個(gè)氨基和羧基，在不同的酸度條件下呈現(xiàn)不同的形態(tài)。而不同形態(tài)的多肽類抗生素在質(zhì)譜中的電離程度差別較大，因此需要合適的酸度環(huán)境使多肽類物質(zhì)有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸-乙腈（1∶9，V/V）作為復(fù)溶的溶解液，1 h后粘桿菌素的響應(yīng)值減半，4 h后檢測(cè)不到粘桿菌素A和粘桿菌素B，其它3種多肽類物質(zhì)可以穩(wěn)定存在。調(diào)節(jié)溶解液酸度和有機(jī)相比例，發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸-乙腈（1∶9，V/V）可以使粘桿菌素在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定，此時(shí)pH值約為2.5。

3.5 方法的線性范圍與檢出限

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種多肽的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。以信噪比為3估算檢出限（LOD），5種多肽的檢出限見表2。

3.6 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品分析

采用經(jīng)測(cè)定不含有多肽類抗生素的牛奶樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品添加25， 50和100

@ g/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜， 進(jìn)樣測(cè)定。平均添加回收率（每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次）為75.1%～120.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.7，結(jié)果見表2。

采用本方法對(duì)當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上的50例牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，僅有1例檢出含有桿菌肽A的陽(yáng)性樣品， 但尚未超標(biāo)。



References

1 Beringer P. Curr. Opin. Pulmon. Med.， 2001， 7（6）:434～440

2 Evans M E， Feola D J， Rapp R P. Ann. Pharmacother， 1999， 33（9）: 960～967

3 Hanberger H， Diekema D， Fluit A， Struelens J M， Spencer R， Wolff M. J. Hosp. Infect.， 2001， 48（3）: 161～176

4 LIN Wei-Xuan， SUN Xing-Quan， TIAN Miao（林維宣，孫興權(quán)，田 苗）. Journal of Instrumental Analysis （分析測(cè)試學(xué)報(bào)） ， 2009， 28（2）: 212 ～215

5 Decolin D， Leroy P， Nicolas A， Archimbault P. J. Chromatogr.， 1997， 35（12）: 557～564

6 Della W S， Ho C， Wong Y C. Anal. Chim. Acta， 2005， 535（1-2）: 23～31

7 Morales-Muoz S， de Castro M D L. J. Chromatogr. A， 2005， 1066（1-2）: 1～7

8 GENG Zhi-Ming， CHEN Ming， XU Da-Guang（耿志明， 陳 明， 許大光）. Chinese Journal of Veterinary Drug（中國(guó)獸藥雜志）， 2005， 39（2）: 10～13

9 DAI Zhi-Yong， LI Xin-Zhong， YIN Tao， LUO Jian（戴智勇， 李新中， 尹 桃， 羅 健）. Chinese Journal of Antibiotics（中國(guó)抗生素雜志）2002， 27（10）: 599～600

10 Kang J W， De Reymaker G， van Schepdael A， Van Schepdael A， Roets E， Hoogmartens J. Electrophoresis， 2001， 22（7）: 1356～1362

11 Wan E C， Ho C， Sin D W， Wong Y. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 385（1）:181～188

Simultaneous Determination of 5 Peptide Antibiotics in Bovine Milk

Samples by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Jia-Jia， JIN Fen， SHE Yong-Xin， LIU Hong-Bin， SHI Xiao-Mei， WANG Miao，

WANG Jing， XU Si-Yuan

（Key Lab of Agro-product Quality and Safety， Institute of Quality Standards Testing Technology for Agro-products，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）

Abstract A sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometric （LC-MS/MS） method has been developed for simultaneous determination of bacitracin， colistin A， colistin B， virginiamycin and vancomycin in bovine milk samples. Milk samples were extracted with a mixture of methanol 0.1% formic acid and water， and deproteinized with 4% trichloroacetic acid in acetonitrile. The five peptide antibiotics in the extract were separated on a reversed phase using a gradient elution program of 0.1% formic acid aqueous solution （A） and 0.1% formic acid in acetonitrile solution （B）. Using LC-MS/MS （ESI） with multiple reaction monitoring （MRM）， identification of the major components of the five kinds of peptide antibiotics was performed based upon the intensities of mass fragments from the respective doubly or triply charged precursor ions. The recoveries were 75.1%－120.1% for the five polypeptides at spiked levels of 25， 50 and 100

@ g/kg， and the relative standard deviation （RSD） was less than 15.7%.The limit of detection （LOD） for the five peptide antibiotics was 0.2－5.6

@ g/kg. The method is suitable for quantitative and qualitative analysis of peptide antibiotics in a sufficient number of samples with simplicity， sensitivity and repeatability， and which could meet the request of peptide antibiotic residue testing at home and abroad.

Keywords High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Milk; Peptide antibiotics; Residue

（Received 28 July 2010; accepted 10 November 2010）