泡沫浮選-固相提取分離富集三七提取液中的人參皂苷

摘 要 采用泡沫浮選-固相提取聯用法，分離富集三七中的R1，Rg1， Re， Rc， Rb2， Rb3， Rd和 Rb1，并用液相色譜法測定其含量，檢測靈敏度和選擇性都有所提高。對泡沫浮選過程的載氣流量、浮選時間、樣品溶液pH值和固相提取柱的洗脫條件進行了優化。原人參二醇型皂苷R1，Rc， Rb2， Rb3， Rd， 和 Rb1的回收率在85.0%～97.5% 之間，而原三醇型皂苷Rg1和Re的回收率很低。原人參二醇型皂苷測定的相對標準偏差都小于603%。本研究為分離純化三七提取液中低濃度原人參二醇型皂苷的簡便有效的方法。

關鍵詞 固相提取； 泡沫浮選； 高效液相色譜； 三七; 人參皂苷

1 引 言

三七（ Panax notoginsen （Burk.）F. H. Chen）是五加科植物，有散瘀止血、消腫止痛的功效。三七中含有多種人參皂苷及與人參皂苷類似的成分。人參皂苷具有耐缺氧、降血糖血脂、改善微循環、增強機體免疫力、抗炎、抗衰老、保護心肌、保護腦組織及抗肥胖等多種藥理活性。人參皂苷按其苷元部分的結構不同主要分為原人參二醇型皂苷、原人參三醇型皂苷和齊墩果酸。泡沫浮選法是基于溶液中待分離組分具有表面活性，或通過向其中加入表面活性劑將目標物帶出溶液主體使之分離濃縮的方法，廣泛應用于金屬離子、表面活性劑、蛋白質及中藥有效成分的分離富集。人參皂苷具有表面活性劑的特性， 在攪拌或通入氣體時可產生穩定的泡沫， 因此可采用浮選分離技術對其進行分離富集。但是當溶液中待測物濃度很低時，即使進行了泡沫浮選富集后也檢測不到目標物。固相提取法雖然方便簡單，但是當樣品溶液量大時耗時長。本研究采用泡沫浮選與固相提取聯用法分離富集三七提取液中的人參皂苷， 同時進行了2次分離富集，為分離富集溶液中低濃度物質提供了新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（日本島津公司）; KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司） ; 3202S型酸度計（瑞士Mettler公司） ; Heidolph旋轉蒸發儀（德國） ; OASIS HLB 固相提取柱 （1 mL， 10 mg， 美國Waters公司）；自制浮選裝置如圖1所示。

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8種人參皂苷（純度均為99%）R1，Rg1 ， Re， Rb1 ， Rc， Rb2，Rb3 和Rd購自中國藥品生物制品檢定所，用甲醇溶解得到不同濃度的人參皂苷標準溶液。 三七樣品購于當地藥店。乙腈（HPLC級）， 其它試劑均為分析純。實驗用水經過MilliQ系統純化。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 將樣品烘干，粉碎過孔徑為425

@ m的篩子，用三氯甲烷加熱脫脂3 h，自然晾干備用。稱取20 mg樣品，超聲提取2 h，在50 ℃下旋轉蒸發至干，加入160 mL水， 制得樣品溶液。稱取20 mg樣品，加入適量標準溶液，攪拌24 h，氮氣吹干，制成加標樣品，并按上述方法制成加標樣品溶液。

2.2.2 泡沫浮選-固相提取 如圖1所示，將樣品溶液過濾后加入浮選瓶中。浮選瓶的截面積直徑為5 cm，將氮氣以一定流速通過浮選瓶和固相提取柱，其中泡沫未經過破乳直接引入固相提取柱，富集完全后用適量洗脫劑洗脫固相提取柱。洗脫液引入HPLC分析。 圖1 泡沫浮選-固相提取聯用裝置

Fig．1 Foam flotation-SPE system

2.2.3 固相提取 通過固相提取柱的溶液約為7 mL。為了進行比較，取7 mL樣品溶液，以2 mL/min的流速通過固相提取柱，用500

@ L甲醇洗脫，將洗脫液過濾，引入HPLC進行分析。

2.2.4 泡沫浮選 將160 mL樣品溶液倒入浮選瓶中進行泡沫浮選，不經過固相提取柱，將浮選液過濾，引入HPLC進行分析。

2.2.5 色譜條件 Eclipse XDB C8 色譜柱（416 mm ×150 mm， 5

@ m） ， 柱溫25 ℃，流動相流量1.5 mL/min，進樣體積20

@ L，檢測波長為203 nm。流動相為乙腈（A）和水（B）， 梯度洗脫：0～25 min， 18% A；25～26 min，18%～30% A；26～50 min，30%A。

3 結果與討論

3.1 泡沫浮選條件的優化

3.1.1 載氣流量 實驗結果表明，當載氣流量較小時，載氣的載帶能力較弱，不能有效地將人參皂苷從溶液中帶至溶液表層。隨著載氣流量的增大，人參皂苷的收率先升后降。這可能是由于當載氣流量過大時，溶液中產生渦旋將溶液表層的泡沫帶回到溶液中，同時富集的雜質也增多，導致人參皂苷的收率降低。因此選擇40 mL/min作為最佳載氣流量。

3.1.2 浮選時間 由圖2a可知，浮選時間過短，人參皂苷的富集不完全；浮選30 min后，人參皂苷的收率基本不變，因此浮選時間選擇30 min。

圖2 浮選時間（a）和樣品液pH值（b）對人參皂苷收率的影響

Fig．2 Effect of floatation time （a） and pH value of sample solution （b） on yields of ginsenosides

3.1.3 樣品溶液pH值 考察了樣品溶液pH值對浮選效率的影響， 結果如圖2b所示。隨著溶液pH值的增加，人參皂苷的收率先升后降，可能是由于pH值影響人參皂苷的存在形式。pH值過高時，人參皂苷可能發生降解，影響收率。為了分離二醇組皂苷和三醇組皂苷，同時富集二醇組皂苷，pH值選擇9.0。

3.2 固相提取條件的優化

3.2.1 洗脫劑的選擇 比較了甲醇、乙醇、丙酮和乙腈為洗脫劑時人參皂苷的收率。由圖3可知，以甲醇為洗脫劑時洗脫效果最佳，因此選擇甲醇為洗脫劑。

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3.2.2 洗脫劑流量 由圖4可見，洗脫劑流量對Rb1的收率有較大影響，對其它人參皂苷收率的影響不大。當洗脫劑流量為37.5

@ L/min時， Rb1的洗脫效果最佳。本研究中洗脫劑流量選擇為37.5

@ L/min。

圖3 洗脫劑對人參皂苷收率的影響

Fig．3 Effect of type of elution solvent on yields of ginsenosides

圖4 洗脫液流速對人參皂苷含量的影響

Fig．4 Effect of flow rate of elution solvent on yields of ginsenosides

3.2.3 洗脫劑用量 洗脫劑用量從200

@ L增加到 400

@ L時，均不能將被測物完全洗脫；洗脫劑用量達到500

@ L才能得到滿意的收率。因此本研究中洗脫劑用量選擇500

@ L。

3.3 泡沫浮選法、固相提取法及泡沫浮選-固相提取聯用法的比較

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由圖5可知，樣品溶液中人參皂苷的濃度過低， 分別使用泡沫浮選法和固相提取法富集其中的人參皂苷，二者的富集效果均不佳。采用泡沫浮選-固相提取聯用法對樣品液中低濃度人參皂苷進行分離富集， 其結果令人滿意。

圖5 樣品經（a）固相提取法、（b）泡沫浮選法及（c）泡沫浮選-固相提取法富集后的液相色譜圖

Fig．5 Chromatograms of analytical solution obtained by （a） SPE， （b） foam floatation （FF） and （c）FF-SPE

1. R1; 2. Rg1; 3. Re; 4. Rb1 ; 5.Rc; 6. Rb2; 7. Rb3; 8. Rd\\.

3.4 標準曲線

以人參皂苷濃度（c）為橫坐標，色譜峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，對應的線性回歸方程和檢出限（LOD）見表1。

由表3可知，除了三醇組皂苷外，二醇組皂苷R1，Rc， Rb2， Rb3， Rd和Rb1均得到了令人滿意的回收率。實驗表明，本方法可以將二醇組皂苷與三醇組皂苷分離，并且富集了二醇組皂苷。

表3 加標樣品中人參皂苷的回收率

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Separation and Enrichment of Ginsenosides from Extracts

of Root of Panax Notoginsen Burk. F. H. Chen. by

Foam Floatation-Solid Phase Extraction

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ZHANG Rui， LI Na， ZHANG Han-Qi， WANG Ying， GAO Shi-Qian， REN Rui-Bing， SUN Ying

（College of Chemistry Jilin University， Changchun 130012）

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Abstract Foam floatation-solid phase extraction was applied to the separation and enrichment of ginsenosides from extracts of Panax notoginsen （Burk.） F. H. Chen. The selectivity and sensitivity for determining the ginsenosides were improved. The experimental conditions， including the flow rate of nitrogen gas， floatation time and pH value of sample solution， for foam floatation and elution conditions for SPE were examined and optimized. Average recoveries for protopanaxdiol （PPD） ginse-nosides Rc， Rb2， Rb3， Rd， and Rb1 were between 85.01% and 97.51%. The relative standard deviations （RSDs） were lower than 5.8% for the PPD ginsenosides. The FF-SPE was applied to both the separation and concentration for the PPD ginsenosides. The proposed method shows a potential in the separation and concentration of trace analytes in the solution samples.

Keywords Solid phase extraction; Foam floatation; High performance liquid chromatography; Panax notoginsen（Burk.）F. H. Chen.; Ginsenosides; 

（Received 27 August 2010; accepted 1 November 2010）

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