超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定牛肉中青霉素類藥物及其代謝產物

摘 要 建立了同時檢測牛肉中2種青霉素（阿莫西林和青霉素G）及其5種主要代謝產物的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。牛肉樣品加入青霉素V為內標，經乙腈提取后，在UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.8

SymbolmA@ m）上分離，以乙腈和添加0.15%甲酸與5 mmol/L乙酸銨的水溶液（pH 2.8）作為流動相，采用梯度洗脫程序， 正離子電噴霧多反應監測（MRM）模式檢測，一次進樣分析需8 min， 基體匹配標準內標法定量。方法學確證表明：牛肉樣品的線性范圍為25～2500

SymbolmA@ g/kg，各被測物質的線性相關系數均大于099，加標回收率為91%～106%，相對標準偏差為2%～9%（n＝6），樣品的檢出限為0.05～3.0

SymbolmA@ g/kg（S/N＞3），定量限均為25

SymbolmA@ g/kg（S/N＞10）。本方法靈敏度高，重復性良好，為生物組織樣品中青霉素類藥物的代謝研究提供了分析基礎。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜法； 牛肉； 阿莫西林； 青霉素G； 代謝物

1 引 言

阿莫西林（Amoxicillin）和青霉素G（Penicillin G）均屬于β-內酰胺類抗生素，廣泛應用于人和動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等疾病\\，同時也是目前治療奶牛乳腺炎的首選藥物。然而，用藥不規范會導致藥物在奶和動物組織中的殘留，食品中痕量的青霉素或其代謝物殘留對青霉素過敏的人有潛在的健康危害\\，已有文獻報道在食用青霉素殘留的食品后產生過敏反應的案例\\。阿莫西林和青霉素G易通過β-內酰胺開環生成主要代謝產物，阿莫西林的主要代謝產物為阿莫西林噻唑酸（Amoxicilloic acid）和阿莫西林二酮哌嗪（Amoxicillin diketopiperazine-2′，5′-dione），青霉素G的3種主要代謝產物為芐青霉噻唑酸（Benzylpenicilloic acid）、芐青霉去羧噻唑酸（Benzylpenilloic acid）和芐青霉二酸（Benzyl-penillic acid）。文獻\\報道，3%～5%的青霉素過敏反應與這些代謝物有關。

有關動物性食品中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測方法已有報道\\，但關于其代謝物的研究較少。De Baere等\\建立了豬組織中阿莫西林、阿莫西林噻唑酸和阿莫西林二酮哌嗪的LC-MS/MS檢測方法。但是該方法使用三氯乙酸（TCA）去除蛋白，降低了阿莫西林和阿莫西林噻唑酸的穩定性，代謝物在反相Hypersil色譜柱上并未獲得完全分離，離子對試劑（PFPA）的使用會抑制MS/MS的響應信號。Reyns等\\使用聚合型PLRP-S色譜柱和超濾前處理方法克服了前一方法出現的問題\\，然而改進的方法在色譜分離和平衡過程耗時較長。Li等\\利用LC-ESI-MS法研究了青霉素生產廠排出的廢水和接收河流中的青霉素G及其5種主要代謝產物（包括芐青霉噻唑酸、芐青霉去羧噻唑酸、芐青霉二酸）的損耗過程，且該方法使用的選擇離子模式（Selected ion recording， SIR）在復雜基質分析中的靈敏度和特異性并不高。

歐盟標準規定了牛肉中青霉素G和阿莫西林的最高殘留限量（Maximum residue limits， MRLs）均為50

SymbolmA@ g/kg\\。對其代謝物的MRLs尚未規定。青霉素的過敏反應與青霉素的代謝產物有關\\，但迄今未見同時檢測生物組織中青霉素G和阿莫西林代謝產物的報道。因此，建立靈敏快速地檢測牛肉中阿莫西林、青霉素G及其主要代謝產物的方法，對研究生物組織中青霉素類藥物的代謝狀況具有重要意義。

本研究采用超高效液相色譜串聯質譜法同時測定了牛肉中的阿莫西林、阿莫西林噻唑酸、阿莫西林二酮哌嗪、青霉素G、芐青霉噻唑酸、芐青霉去羧噻唑酸和芐青霉二酸。本方法適用于動物性組織中青霉素類藥物的代謝物殘留研究。一次進樣分析僅需8 min。本方法靈敏、簡便、選擇性高。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司），配有電噴霧離子源，Masslynx 4.1工作站；MS2渦旋振蕩器和柱桿式組織勻漿機（德國IKA公司）； KQ-500DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；R-215旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；水相濾膜（0.22

SymbolmA@ m，天津津騰實驗設備有限公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

乙腈和甲醇（HPLC級，美國Fisher公司）；甲酸（HPLC級，美國Acros Organics公司）；乙醇、NaCl和乙酸銨（分析純，北京化工廠）；阿莫西林（純度98.5%）、青霉素G（純度99.0%）和青霉素V（純度98.8%）購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；阿莫西林噻唑酸（純度98.3%）、阿莫西林二酮哌嗪（純度98.2%）、芐青霉噻唑酸（純度98.6%）、芐青霉去羧噻唑酸（純度97.9%）和芐青霉二酸（純度98.3%）由中國動物疫病預防控制中心提供； 8種標準物質用乙腈/水（50∶50， V/V）配制成1000 mg/L標準儲備液，保存于4 ℃冰箱中。

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細管電壓3.5 kV；射頻透鏡電壓0.5 V；離子源溫度110 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；光電倍增器電壓650 V；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓0.27 Pa；多反應監測（MRM）模式檢測。其它質譜參數見表1。

運行開始時，色譜柱流出液經六通切換閥切換至廢液中，直到1.5 min。質譜從1.5 min開始采集數據直到6.0 min結束，同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2.3 牛肉樣品的前處理

準確稱取切碎均質良好的樣品4 g于50 mL具塞離心管中，加入青霉素V內標50

SymbolmA@ g/kg，渦旋1 min，加2 mL水，添加乙腈至20 mL，用柱桿式組織勻漿機勻漿提取1 min，以5000 r/min離心10 min。取10 mL上層清液裝入雞心瓶中，加入100

SymbolmA@ L飽和NaCl溶液，于40 ℃水浴旋蒸至干。蒸干后立即加入2 mL乙酸銨緩沖溶液（pH 6.7）溶解殘余物，渦旋15 s，加入5 mL正己烷，渦旋1 min，轉移至50 mL離心管中，以6000 r/min離心5 min，去除上層有機相，正己烷重復去脂一次。最后吸取1 mL水相于2 mL聚丙烯離心管中，以12000 r/min離心10 min，過0.22

SymbolmA@ m水相濾膜，待測。

同時在7支離心管中分別按標準曲線的濃度加入適量標準溶液，再加入4 g空白牛肉，混勻，放置10 min后，與樣品一起處理，制作工作曲線系列。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的優化

在ESI＋和ESI－離子化模式下，分別進行全掃描以選擇適當的電離方式和準分子離子峰。實驗表明，所有目標分析物在離子源ESI＋電離方式下，可獲得較高豐度的\\＋母離子。7種目標分析物和內標的二級質譜圖及其結構見圖1。在確定各目標分析物的母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質譜分析，對子離子進行了優化選擇，確定定量離子和輔助定性離子，通過優化毛細管電壓、一級錐孔電壓、二級錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量、質譜分辨率等質譜參數，使每種分析物的準分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大。

圖1 阿莫西林（a）、阿莫西林噻唑酸（b）、阿莫西林二酮哌嗪（c）、青霉素G（d）、芐青霉噻唑酸（e）、芐青霉去羧噻唑酸（f）、芐青霉二酸（g）和青霉素V（h）的電噴霧二級質譜圖

Fig．1 Product ion mass spectra of amoxicillin （a）， amoxicilloic acid （b）， amoxicillin diketopiperazine-2′，5′-dione （c）， penicillin G （d）， benzylpenicilloic acid （e）， benzylpenilloic acid （f）， benzylpenillic acid （g） and penicillin V （h）

3.2 色譜條件的優化

選擇UPLC HSS T3色譜柱（三鍵C18烷基鍵合）作為分析柱，對比了甲醇-水和乙腈-水兩個體系的分離效果，二者對目標化合物分離度的影響差異不大，但乙腈-水體系的峰形好于甲醇-水體系，本實驗選擇乙腈-水體系作為流動相。由于大部分青霉素類藥物及其代謝物在水溶液中以離子狀態存在，所以為了增強待測物在反相色譜柱上的保留，提高分離度及改善峰形，通常在流動相中加入酸性物質（如甲酸、乙酸等）或緩沖鹽（如甲酸銨、乙酸銨等）。本實驗同時在流動相中加入甲酸和乙酸銨提高靈敏度、改善分離效果。固定水相中甲酸的含量為0.1%（V/V），考察添加0.5， 1， 2.5和5.0 mmol/L 乙酸銨對分離度的影響。隨著乙酸銨添加濃度的增加，分離度逐漸提高，當添加濃度為5 mmol/L時，各物質已達到完全分離，但靈敏度逐漸降低。在5 mmol/L乙酸銨溶液中添加甲酸，考察0.05%， 0.1%， 0.15%和0.2%甲酸（V/V）對靈敏度的影響。實驗表明，甲酸濃度對靈敏度的影響差異不大。本實驗選擇乙腈-水（含015%甲酸和5 mmol/L乙酸銨）液作為流動相。圖2為最優色譜條件下各目標物質的總離子流色譜圖。

圖2 青霉素類藥物及其代謝物標樣的總離子流色譜圖

Fig．2 Total ion chromatogram of penicillins and their

metabolites standard samples

1. 阿莫西林噻唑酸（Amoxicilloic acid）；2. 阿莫西林（Amoxicillin）；3. 芐青霉二酸（Benzylpenillic acid）；4. 阿莫西林二酮哌嗪（Amoxicillin diketopiperazine-2′，5′-dione）；5. 芐青霉噻唑酸（Benzylpenicilloic acid）；6. 芐青霉去羧噻唑酸（Benzylpenilloic acid）；7. 青霉素G（Penicillin G）；8. 青霉素V（Penicillin V）。

3.3 樣品前處理方法的優化

青霉素類藥物在酸性或堿性溶液中均不穩定，所以在本實驗初期階段只研究了Oasis HLB固相萃取柱的凈化效果。結果表明，目標化合物的絕對回收率差異較大（5%～95%），其中阿莫西林和阿莫西林噻唑酸由于極性很高，導致回收率很小，而且其回收率重現性較差。所以固相萃取方法不適于本實驗。

比較了甲醇、乙醇和乙腈為提取劑的效果。結果表明，乙腈提取效果最好，沉淀蛋白完全，易于離心分離。為了防止乙腈提取液在旋蒸過程中暴沸，加入了適量NaCl飽和溶液\\。加入乙酸銨緩沖液溶解旋蒸后的殘余物可以減少待測物的降解\\。正己烷的去脂過程可以進一步凈化樣品溶液，減少樣品對UPLC-MS/MS系統的污染。在分析測試時，樣品處理液中強極性和弱極性雜質成分使用六通切換閥切換至廢液而不進入質譜儀，分析多份樣品后不需清洗質譜儀的樣品錐，同時采用基體匹配標準內標法定量，有效補償了基體效應，方法簡單、快速。

3.4 線性范圍和檢出限

用空白樣品加入標準溶液制作7點系列標準工作溶液，在選定的色譜和質譜條件下進行測定。采用Masslynx 4.1中Quanlynx組件以目標物質的定量離子與內標定量離子峰面積的比值對基質標準系列濃度作圖，牛肉中7種待測物質的線性相關系數在0.9952～0.9995之間，線性關系良好。在實驗條件下，信噪比為3時，定量離子對信號對應的樣品濃度作為檢出限（LOD）；定量限則設定為最高殘留限量的1/2（25

SymbolmA@ g/kg）。結果顯示，定量限濃度的信噪比均大于10，具體結果見表2。本方法靈敏度高，線性范圍寬，能夠滿足食品中獸藥殘留分析的要求。如果樣品濃度過高，則應稀釋后重新進樣測定。

3.5 方法的回收率和精密度

用空白牛肉進行加標回收和精密度實驗，樣品添加不同濃度的標準溶液后，渦旋混勻，于室溫放置10 min，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再按照樣品前處理方法進行操作，用超高效液相色譜-串聯四極桿質譜進樣測定，其回收率和精密度結果見表3。牛肉樣品的加標回收率在91%～106%范圍內，相對標準偏差為2%～9%，符合獸藥殘留分析的要求。通過比較牛肉的加標樣品和空白樣品的色譜圖可發現，沒有內源性物質對目標分析物的檢測產生干擾。

3.6 樣品測定

應用本方法對20份采集自市場的牛肉樣品進行測定，均未檢出上述青霉素類藥物及其代謝物。下一步工作將擴大樣品采集地點和采集種類，對可疑的樣品進行篩查確證。

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Simultaneous Determination of 2 Penicillins and Their 5 Major

Metabolites in Bovine Muscle by Ultra Performance Liquid

Chromatography Tandem Mass Spectrometry



LIU Chuang-Ji1， WANG Hai2， DU Zhen-Xia1， JIANG Yan-Bin2， SHAN Ji-Hao2， CAI Ying-Hua2

1（College of Science， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029）

2（China Animal Disease Control Center， Beijing 100125）

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Abstract A comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 2 penicillins （amoxicillin and penicillin G） and their 5 major metabolites. Penicillin V was used as the internal standard in this method. Bovine muscle sample was prepared by precipitation of proteins with acetonitrile. The penicillins was analyzed on an ACQUITY UPLC HSS T3 column 100 mm×2.1 mm， 1.8

SymbolmA@ m using a mixture of 0.15% formic acid in water with 5 mmol/L ammonium acetate （pH 2.8） and acetonitrile as the mobile phase and a gradient program with a cycle time of 8 min， and detected by positive electrospray ionization tandem mass spectrometry in the MRM mode， and quantified by matrix-match internal standard solution. The standard curves were linear in the range of 25－2500

SymbolmA@ g/kg for bovine muscle. The average recoveries were 91%－106% with RSDs of 2%－9% （n＝6）. The detection limits （S/N＞3） of the 8 analytes were 0.05－3.0

SymbolmA@ g/kg， the limits of quantitation （S/N＞10） were all 25

SymbolmA@ g/kg. The method is sensitive and repeatable， and can be applied to the field of residue analysis about penicillins and their metabolites.

Keywords Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Bovine muscle; Amoxicillin; Penicillin G; Metabolites

（Received 9 September 2010; accepted 10 January 2011）

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文