高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜研究Medaka體內水溶性汞結合蛋白

摘 要 采用高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用技術，對不同形態汞暴露后的Medaka肝臟和腦組織中水溶性蛋白進行研究，以體積排阻柱為液相分離柱，流動相為0.15 mol/L NH4Ac，流速為0.5 mL/ min。利用電感耦合等離子體質譜對Medaka肝臟和腦組織提取液中銅、鋅和汞的含量進行了分析，檢出限為0.01～005

SymbolmA@ g/L，元素的加標回收率為93.1%～97.0%。通過與空白組對比發現，汞暴露后的Medaka魚體肝臟和腦組織對水體中的汞有一定程度的富集；不同形態汞暴露后，在Medaka肝臟和腦組織中的分布明顯不同，并且都會在一定程度上降低Medaka肝臟和腦組織中銅與鋅的含量，有利于進一步研究汞在生物體內的毒性機理。

關鍵詞 高效液相色譜； 電感耦合等離子體質譜； 汞結合蛋白

1 引 言

汞因其特殊的物理化學性質，一直被廣泛應用。但汞具有較高的生物毒性，如神經毒性和腎臟毒性\\。自20世紀50年代日本水俁病爆發后，對于汞毒性的研究備受關注，汞污染已經成為一個全球性污染問題\\。汞的主要存在形式是單質汞、無機汞和有機汞。不同形態的汞在環境中和生物體中可以相互轉化，并且對生物體的毒性也不相同\\。環境中的汞污染物被動植物吸收后在生物鏈中逐漸富集傳遞進入人體，在被人體腸道吸收后，富集在肝、胃、腦組織等部位，對中樞神經造成危害\\，嚴重的可導致死亡。目前，對于汞的研究主要集中在對環境和生物體中總汞的測定\\，以及小分子的有機汞和無機汞的形態分析\\，但是汞在生物體內吸收、遷移、轉化和代謝的途徑以及與生物活性分子結合后對生物活性影響的機理尚不十分清楚。

隨著金屬組學概念的提出，人們對于金屬的研究重點已經從總量測定和小分子的形態分析，轉移到金屬與生物大分子的相互作用\\。在金屬結合蛋白的研究中，保證目標蛋白在分離過程中的穩定性十分關鍵。高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）聯用的技術具有接口簡單，高效分離，靈敏度高，前處理簡單等特點，被廣泛應用于生物樣品中金屬結合蛋白的分析\\。 

動物暴露實驗是外源性有毒化合物毒理學研究的常用手段。魚是人類食物攝入汞的主要來源，水體中的汞可通過食物鏈在魚體高度富集，富集倍數高達數十萬倍\\。本研究選用魚類模型作為研究汞化合物毒性機制的簡單有效的實驗動物。日本Medaka （Oryzias latipes）自20世紀80年代被國際標準化組織列為毒性實驗受試種之一，其具有體形小、飼養方便、繁殖周期短、繁殖能力強、對化學毒物敏感等優點，可很好地應用于多種環境污染物的毒理學實驗中，已作為一種國際通用的魚類模型被廣泛使用\\。

本實驗用不同形態的汞對Medaka進行暴露，利用HPLC-ICP-MS聯用技術對甲基汞和無機汞暴露后的Medaka肝臟和腦組織中水溶性汞結合蛋白進行研究，同時還對肝臟和腦組織蛋白提取液中銅、鋅和汞的含量進行了測定，有助于進一步研究不同形態汞在生物體中吸收、遷移、累積、生物轉化及代謝的機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀，7500ce型電感耦合等離子體質譜儀（美國Agilent公司）。

HgCl2（≥99.5，北京化工廠）; 氯化甲基汞（≥98%，德國Merck公司）; HNO3（GR，65%。德國Merck公司）； 甲醇（HPLC純，美國Baker公司）； 乙酸銨（GR，北京化工廠）; Tris （超純級，美國Solon公司）。除特別指明外，其它試劑均為分析純。去離子水（18.3 MΩ cm）來自超純水系統（Barnstead International， Dubuque， IA， USA）。

取適量HgCl2和氯化甲基汞，分別溶于5%（V/V）HNO3-甲醇混合溶液中，配制成含1000 mg/L Hg的標準儲備液，密封于棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存。

2.2 動物汞染毒實驗

實驗用魚養殖在與實驗用水的水質、溫度和光照一致的循環流動水系統中，在標準無病害環境下，每天投喂市售豐年蟲2次。循環水為自來水經活性炭多層過濾純化，預先至少曝氣24 h以上，其水質參數如下：pH 6.9～7.9；溶解氧濃度為5～7 mg/L；硬度為CaCO3 200 mg/L；電導率為650

SymbolmA@ S/cm；水溫保持在22.5～25.5 ℃范圍內。白天/黑夜循環時間是12 h/12 h。養殖密度為每升水1 g魚。實驗用魚均健康并適于常規毒理學暴露實驗。

氯化甲基汞和HgCl2染毒實驗均為靜水暴露方式。選取8月齡Medaka （Oryzias latipes）成魚，平均體長3.59 cm，平均體重0.52 g，隨機分為空白對照組、HgCl2暴露組和氯化甲基汞暴露組，每組20條，暴露組的Hg暴露濃度為20

SymbolmA@ g/L。為了保證合適的水質和穩定的暴露濃度，每日更換暴露溶液。

2.3 樣品制備

暴露1周后，解剖取魚肝臟和腦組織，用0.05 mol/L Tris-HAc緩沖溶液（1∶50，w/w， pH 7.4）勻漿，在4 ℃以12000 r/min離心30 min，取上清液用0.45

SymbolmA@ m的水性濾膜進行過濾，用于實驗分析。

2.4 HPLC-UV-ICP-MS分析

蛋白提取液用高效液相色譜進行分離，色譜柱為Nanofilm SEC150體積排阻色譜柱（Sepax Technologies），流動相為0.15 mol/L NH4Ac，流速為0.5 mL/min，進樣量20

SymbolmA@ L，紫外檢測波長為254 nm。HPLC的流出液用PEEK管直接接入ICP-MS，進行202Hg在線監測。ICP-MS的參數：石英雙通道霧室，同心霧化器，RF功率1550 W，載氣流速0.85 L/min，輔氣流速0.37 L/min，霧室溫度2 ℃，測定同位素202Hg。

2.5 提取液中金屬總量的測定

配制濃度為1.0，5.0，10.0，20.0和50.0

SymbolmA@ g/L的系列Cu， Zn和Hg混合標準溶液，用ICP-MS測量同位素63Cu，66Zn和202Hg，繪制標準曲線。肝臟和腦組織的蛋白提取液用5% HNO3稀釋20倍，用ICP-MS直接測定提取液中Cu， Zn和Hg的含量。以Ge和In為內標，每個樣品平行測定3次。

3 結果與討論

3.1 不同形態汞暴露后Medaka肝臟提取液的HPLC-ICP-MS分析

用HPLC-ICP-MS對Medaka肝臟提取液進行分析，如圖1所示。通過與空白組對比可見，經過無機汞和甲基汞暴露后的Medaka肝臟中均有一定量的汞富集。對比HPLC紫外譜圖和ICP-MS質譜圖的保留時間發現，汞暴露組Medaka肝臟提取液中均含有3個汞結合蛋白/多肽，保留時間分別為4.5，5.4和6.7 min，通過標準蛋白計算其相對應的分子量分別為199，70和14 kDa。在監測Hg的同時，還對Medaka肝臟提取液中的Cu和Zn進行了監測，結果發現，目標蛋白在結合了Hg的同時，還結合了大量Cu2＋和Zn2＋。金屬硫蛋白（MT）是一種富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，分子量為6～7 kDa，有4種異構體MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ和MT-Ⅳ，其中MT-Ⅰ和MT-Ⅱ主要分布在肝臟和腎臟中\\。根據分子量推測，保留時間為6.7 min的汞結合蛋白可能是金屬硫蛋白的聚合物，或者是金屬硫蛋白與其它蛋白相互作用后形成的蛋白復合物。但是對于Medaka肝臟提取液中汞結合蛋白的準確結構的確定尚有待深入研究。

對比無機汞暴露組和甲基汞暴露組Medaka肝臟提取液的ICP-MS質譜圖還可以發現，不同形態汞暴露后，汞在Medaka肝臟中的分布模式存在一定差異。甲基汞暴露后，Hg主要結合在保留時間6.7 min的蛋白片段上，而無機汞暴露組的汞主要結合在保留時間4.5 min的蛋白片段上。

圖1 肝臟提取液的HPLC-ICP-MS譜圖

Fig．1 HPLC-ICP-MS spectra of liver extract

A. 空白組（Control group）; B. 甲基汞暴露組（Exposure group of MeHgCl）; C. 無機汞暴露組 （Exposure group of HgCl2）。

3.2 不同形態汞暴露后Medaka腦組織提取液的HPLC-ICP-MS分析

Medaka腦組織提取液的HPLC-ICP-MS分析結果如圖2所示。不同形態汞暴露后Medaka腦組織中均富集了一定量的汞，并且含有3個汞結合蛋白/多肽片段，保留時間分別為4.4，5.5和7.1 min，相對應的分子量為209，70和6 kDa。通過對Cu和Zn的監測發現，Medaka腦組織提取液中的汞結合蛋白片段上也含有大量的Cu和Zn。保留時間為6.7 min的汞結合蛋白與金屬硫蛋白的分子量大小相符，推斷其可能為金屬硫蛋白。Aschner等\\研究發現，甲基汞會富集星形膠質細胞中，并且誘發星形膠質細胞合成金屬硫蛋白。

圖2 腦組織提取液的HPLC-ICP-MS譜圖

Fig．2 Analysis of brain extraction by HPLC-ICP-MS

A. 空白組 （control group）； B. 甲基汞暴露組 （Exposure group of MeHgCl）; C. 無機汞暴露組 （Exposure group of HgCl2）。

無機汞和甲基汞暴露組中的Medaka腦組織提取液中汞元素的分布存在較大差異。無機汞暴露組Medaka腦組織提取液中汞主要分布在保留時間為4.4 min的蛋白片段上，而甲基汞暴露組中Medaka腦組織提取液中的汞主要分布在保留時間為5.5 min的蛋白片段上。

3.3 不同形態汞暴露后Medaka肝臟和腦組織中Cu， Zn和Hg的總量測定

應用ICP-MS測定Medaka肝臟和腦組織提取液中的Cu， Zn和Hg的干擾主要來源于質譜干擾及生物樣品的基體效應。本實驗通過優化儀器條件、稀釋樣品、內標矯正、標準加入等方法消除干擾。同時在總量的測量過程中在線加入1 mg/L Ge和In內標溶液，可以有效克服儀器漂移，保證實驗測定的準確性。

Cu， Zn和Hg的標準工作曲線線性相關系數均大于0.9995; 檢出限分別為0.02，0.05和0.01

SymbolmA@ g/L。由于缺少Medaka生物組織提取液的標準參考物質，本實驗采取加標回收法驗證方法的準確性。向空白組Medaka肝臟蛋白提取液中加入1 mg/L的3種金屬的混合標準溶液，測定加標回收率。Cu， Zn和Hg的回收率分別為95.2%，93.1%和97.0%。

用ICP-MS對Medaka肝臟和腦組織提取液中的Cu， Zn和Hg含量進行測定，結果如表1所示。與空白組相比，無機汞暴露組和有機汞暴露組Medaka肝臟提取液和腦組織提取液中的常量元素Cu和Zn的含量都有所下降。結合HPLC-ICP-MS的分析結果，肝臟提取液和腦組織提取液中的Hg結合蛋白上也同時含有Cu和Zn，可以推斷Hg通過暴露進入魚體后，與Cu和Zn結合蛋白或者運輸蛋白上的活性點位或者非活性點位相結合，取代了活性位點上的Cu和Zn，或者改變了生物大分子的正常代謝功能，從而抑制了魚體對Cu和Zn的吸收，導致Medaka腦組織和肝臟組織中Cu和Zn的含量下降。

對比甲基汞暴露組和無機汞暴露組可見，甲基汞暴露組Medaka肝臟提取液和腦組織提取液中的Hg的含量明顯高于無機汞暴露組，這是因為無機汞在消化道內的吸收率小于10%，而甲基汞的吸收率大于90%\\。

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Analysis of Hydrophilic Mercury-Binding Proteins in Medaka （Oryzias

latipes） Using High Performance Liquid Chromatography Coupled

with Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

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LI Lu， HE Bin， JIANG Gui-Bin

（Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology， Research Center for

Eco-Environmental Sciences， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100085）

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Abstract The hydrophilic mercury-binding proteins in the brain and liver extractions of Medaka after methylmercury and inorganic mercury exposure were analyzed by high performance liquid chromato-graphy coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Size exclusion chromatography was selected in the experiment with a mobile phase of 0.15 mol/L NH4Ac， running at a 0.5 mL/min flow rate. Concentrations of total copper， zinc and mercury in the brain and liver extracts of Medaka were determined by ICP-MS. Detection limits for these three elements were in the range of 0.01

SymbolmA@ g/L to 0.05

SymbolmA@ g/L， and the spike recoveries ranged from 93.1%－97.0%. Compared with the control group， high level of mercury is accumulated in the brain and liver of exposure groups. The distribution patterns of mercury-containing proteins in the brain and liver extracts of Medaka between methylmercury and inorganic mercury exposure group were different. The concentrations of copper and zinc in the brain and liver extractions of both exposure groups were decreased. The studies of the mercury-containing protein fractions in Medaka are helpful for the understanding of the mechanisms of mercury toxicity.

Keywords High performance liquid chromatography; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Mercury-containing proteins

（Received 7 December 2010; accepted 4 January 2011）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文