基于光譜成像技術的乳塊消素片活性成分空間分布及均勻性研究

摘 要 建立乳塊消素片活性成分橙皮苷的空間分布和總體成分均勻性的質量控制方法，為片劑生物利用度與成分分布相關性研究提供基礎。采用近/中紅外漫反射光譜成像技術，運用基礎相關系數分析方法，鑒別素片表面橙皮苷成分的分布區; 通過直方圖統計分析，探討素片成分的分布均勻性。橙皮苷近紅外光譜與素片表面光譜的最高相關系數為0.75; 而中紅外光譜與素片表面光譜的最高相關系數可達0.95以上。因此，中紅外光譜成像更適用于乳塊消素片橙皮苷空間分布的構建; 直方圖統計的標準差為0.05～0.09，峰度值為2.84～8.97，偏度值為－1.9～081，判定批次之間成分分布不均勻。研究表明，光譜成像技術可用于中藥片劑成分的空間分布及分布均勻性研究。

關鍵詞 成像技術; 乳塊消片; 空間分布; 均勻性

1 引 言

在生產過程中使用過程分析技術（Process analytical technology，PAT），可增強對生產過程和產品的理解，使產品質量在生產過程中得到控制，而不是依靠成品檢驗在最后環節進行控制。美國食品藥品管理局（FDA）以指導文件的方式向制藥工業發出了通知，支持將過程分析技術作為現行生產質量管理規范（cGMP）更廣泛的開創性組成部分\\。

中藥過程質量控制是對生產過程的關鍵工藝參數和質量指標進行及時測量，并對生產過程進行反饋和控制，以減少生產過程影響質量的不利因素，提高生產效率，降低生產成本，保證產品質量的均一穩定。2008年國家食品藥品監督管理局出臺的《中藥注冊管理補充規定》中，首次明確提出對中藥研制工藝技術參數的要求，并且納入保證中藥質量的控制環節中，結合藥材、成品的質量指標檢測，推進解決中藥質量的不穩定和不均一問題\\。

光譜成像技術具有分析速度快、樣品不需特別預處理、操作簡單、分析成本低等優點，也是FDA推薦的過程分析技術之一\\。它是以樣品表面極小的微元為單位進行光譜信息采集，不僅獲得樣品空間各點的光譜、空間各點的組成和結構信息，還可得到成分在樣品中的空間分布\\。該技術將光學成像和光譜學方法結合起來，已廣泛運用于藥物生產過程質量控制領域\\。本研究以乳塊消中間體素片為例，基于光譜成像技術構建中藥制劑活性成分的光譜成像圖，鑒別其活性成分的空間分布均勻性，初探光譜成像技術在中醫藥領域中的運用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Spectrum Spotlight 400/400N 傅立葉變換近紅外/紅外光譜成像儀（英國PerkinElmer公司）； 16×1陣列MCT檢測器; 乳塊消中間體素片3批（由指定藥廠提供）; 橙皮苷對照品（純度大于98%，科翔生物科技有限公司）。

2.2 實驗方法

采用漫反射方式采集成像光譜。近紅外光譜條件為：以99% Spectralon （英國PerkinElmer公司）為背景．分辨率為16 cm－1，掃描范圍： 7800～4000 cm－1； 掃描次數： 8次； 像元（Pixel）大小為25

@ m×25

@ m; 中紅外光譜條件為：以金鏡片（英國PerkinElmer公司）為背景，分辨率為16 cm－1； 掃描范圍： 4000～750 cm－1； 掃描次數： 8次； 像元（Pixel）大小為25

@ m×25

@ m。

2.3 數據處理及評價參數

Spotlight 400分析系統及Hyper View光譜處理軟件（英國PerkinElmer公司）。光譜經預處理后，再對樣品表面的吸收光譜與橙皮苷對照品的純吸收光譜進行相關性研究，以相關系數（r）為指標進行片劑表面橙皮苷區域的判別，計算方法見公式（1）：

r=∑XiYi－∑Xi∑YiN（∑X2i－（∑Xi）2N）（∑Y2i－（∑Yi）2N）（1）

式中，Xi為樣品表面的吸收光譜; Yi為橙皮苷對照品粉末壓片后所得的橙皮苷純吸收光譜（i=1，2……，n）; N為光譜的變量數。

3 結果與討論

3.1 樣品和橙皮苷對照品近/中紅外光譜預處理

本研究所采集的光譜受片劑表面粗糙程度、空氣中CO2和H2O等因素的影響，噪聲較大，干擾明顯。為了消除背景干擾和噪聲，對所采集的近紅外及中紅外光譜進行了消除噪音、扣除空氣中CO2和H2O干擾、歸一化、SG（Savitzky Golay filter smoothing） 9點平滑數據等預處理，結果見圖1和圖2。圖1中a、c分別為光譜數據預處理前后所構建的樣品表面光譜成像圖，其中13、14、15等不同顏色像元點分別代表化學組成不同的樣品區域。成像光譜數據經預處理后，光譜的毛刺度、噪音干擾等均明顯減小（圖1和圖2中的b和 d比較可以看出光譜這些明顯的變化），使得光譜質量能滿足進一步分析的要求。為了獲得同一狀態下的對照品純光譜，橙皮苷對照品的成像光譜圖采用與樣品同樣的光譜預處理方法（具體見圖3和圖4）。

圖1 樣本的近紅外光譜成像圖

Fig．1 NIR-Chemical Image data results for sample tablets

a. 原始圖像（Original map）; b. 原始代表區域的光譜（Spectra of representative area of original map）; c． 處理后的圖像（Preprocessed map）; d． 處理后代表區域光譜（Spectra of representative area of preprocessed map）。

圖2 樣本的中紅外光譜成像圖

Fig．2 IR-Chemical Image data results for sample tablets

a. 原始圖像（Original map）; b． 原始代表區域的光譜（Spectra of representative area of original map）; c． 處理后的圖像（Preprocessed map）; d． 處理后代表區域光譜（Spectra of representative area of preprocessed map）。

圖3 對照品橙皮苷的近紅外光譜成像圖

Fig．3 NIR-Chemical Image data results for tablets of Hesperidin

a. 原始圖像（Original map）; b． 原始代表區域的光譜（Spectra of representative area of original map）; c． 處理后的圖像（Preprocessed map）; d． 處理后代表區域光譜（Spectra of representative area of preprocessed map）。

圖4 對照品橙皮苷的中紅外光譜成像圖

Fig．4 IR-Chemical Image data results for tablets of Hesperidin

a． 原始圖像（Original map）; b． 原始代表區域的光譜（Spectra of representative area of original map）; c． 處理后的圖像（Preprocessed map）; d． 處理后代表區域光譜（Spectra of representative area of preprocessed map）。

3.2 乳塊消片橙皮苷成分的空間分布鑒別

對光譜進行預處理后，以橙皮苷純光譜的平均譜為對照，對乳塊消素片表面橙皮苷的分布進行相關性分析，結果見圖5。由圖5a和圖5b可知，圖5 樣本中橙皮苷的近/紅外成像相關性圖和成像面上點的相關光譜圖

Fig．5 NIR/IR Imaging data for correlation coefficients between sample spectra and Hesperidin spectra

a. NIR成像；b. 近紅外光譜與素片表面光譜的最高相關系數為0.7058，箭頭指向橙皮苷的純光譜；c. IR成像；d. 中紅外光譜與素片表面光譜的最高相關系數為0.9678，箭頭指向橙皮苷的純光譜。 a. NIR mapping; b. NIR spectra of representative area of the highest correlation（Correlation Coefficient ＝0.7058; Arrowhead points to the spectrum of Hesperidin）;c. IR mapping;d. IR spectra of representative area of the highest correlation （Correlation Coefficient ＝0.9678; Arrowhead points to IR diffuse reflectance spectra of Hesperidin）.

乳塊消素片表面的近紅外光譜與橙皮苷對照品光譜相關系數最高值約為0.7，乳塊消素片中成分與橙皮苷的相關性不理想，可能與橙皮苷在乳塊消素片中的含量偏低、近紅外的靈敏度和信噪比相對較低等因素有關。采用中紅外漫反射的方法對乳塊消素片進行分析。由圖5c和5d可知，乳塊消素片表面的紅外光譜與橙皮苷對照品光譜相關系數最高值達0.9678，相關性明顯提高。圖5c中白色區域與橙皮苷對照品光譜的相關系數均大于0.95，初步確定該區域為橙皮苷的分布區。通過成像統計分析，乳塊消素片表面與橙皮苷光譜相關系數大于0.95的像元占1.2%，這與本課題組前期利用HPLC方法對乳塊消片橙皮苷的含量測定結果具有一定的相關性\\，但準確性相對較低，有待采用化學計量學方法對光譜進行波段篩選，以優化分析結果。

對3個批次75個樣本進行紅外光譜成像分析，計算每個樣品表面光譜與橙皮苷光譜的相關系數，結果見表1。由表1可知，75個樣本表面與橙皮苷對照品的最高相關系數均較高，基本都大于 0.95，個別樣品的最高相關系數在0.92～0.95區間，這類樣品有待對其光譜進行波段優化，篩選特征的譜帶群進行相關性分析。綜上所述，中紅外漫反射成像技術可用于中藥乳塊消素片的成分分布研究。

3.3 乳塊消素片成分總吸收圖的直方圖統計分析

對經光譜預處理的中紅外成像光譜圖，將每個成像點在4000～750 cm－1范圍的吸收值取均值，以均值代表該成像點的吸收值，得到乳塊消素片表面不同成像點的光譜吸收值分布。采用直方圖統計方法對乳塊消素片表面的吸收值分布情況進行分析，結果見圖6及表2。表2為直方圖統計分析所得參數，其中均值為同一樣本表面不同成像點吸收值的均值，可反映不同樣本之間的差異。標準差反映同一樣本表面不同成像點吸收值的離散程度。峰度（Kurtosis）是描述某變量所有取值分布形態陡緩程度的統

圖6 部分乳塊消片成分總吸收圖的直方圖統計分析

Fig．6 Histograms for total absorption distribution of Rukuaixiao tablets. The abscissa denoted average absorbance of pixels in scan wavelength range. The vertical axis denoted number of pixels with absorbance

計量。正態分布的峰度為3； 峰度＜3稱分布具有不足的峰度； 峰度＞3稱分布具有過度的峰度。偏度（Skewness）是描述某變量取值分布對稱性的統計量，可用于檢驗分布的正態性。正態分布的偏度為0，偏度＞0為正偏或右偏，說明數據位于均值右邊的比位于左邊的多，偏度＜0為負偏或左偏，說明數據位于均值左邊的比位于右邊的多。 正偏或負偏均表明同一樣本表面的不同成像點，其吸收值分布偏離正態分布。偏度和峰度表明樣本的分布情況。 Lewis等\\運用偏度和峰度參數指標分析藥物制劑成分分布的均勻性。由表2可知，同一批次樣本的吸光度標準差在0.05～0.09之間，從這一指標可見，數據離散較小; 但偏度值和峰度值的結果顯示，峰度值區間為2.84～8.97，樣本之間吸光度正態分布存在不足和過度的現象，差異較大; 且偏度值區間－1.9～0.81，分布存在左偏或右偏; 偏度值也相對差異較大，因而乳塊消素片之間表面成分的總吸收分布存在左偏態或右偏態，以及分布存在不足和過度等現象，判定批次之間成分分布不均勻。其次，由直方圖可知，乳塊消素片表面成像點的吸收值明顯過高或過低，如2～5和2～7等。因此，這類方法有利于指導中藥制劑過程混合以及中間體乳塊消素片成分均勻性等過程控制參數的考察。

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Research on Spatial Distribution and Composition Uniformity of

Rukuaixiao Tablets Intermediate by Spectral Imaging

WU Zhi-Sheng1， TAO Ou1， CHENG Wei1， YU Lu2， SHI Xin-Yuan1， QIAO Yan-Jiang1

1 （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102）

2（PerkinElmer Instrument Co.， Ltd.， Beijing 100022）

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Abstract To provide the basis of research for the correlation between bioavailability and distribution of ingredients′， the quality control method of active ingredient Hesperidin distribution and composition uniformity of Rukuaixiao tablets intermediate was established. Using Near/Mid-Infrared diffuse reflectance spectral imaging technology， the distribution of the Hesperidin was identified based on correlation analysis method. Composition uniformity was explored by histogram analysis. Near infrared spectral imaging data， the highest correlation coefficient between pure Hesperidin spectra and the spectrum of surface composition was 0.75. As for infrared spectral imaging data， the correlation coefficient was above 0.95. The area was considered as the distribution of Hesperidin （Correlation coefficient ＞0.95）. Furthermore， by histogram analysis of total absorption distribution， the range of value of standard deviation was from 0.05 to 0.09， kurtosis values， 2.84—8.97， skewness value， －1.9—0.81. So the composition of tablets of different batches was believed as more unevenly. Therefore， the spectral imaging technique could be used to construct the spatial composition distribution and composition uniformity of the Traditional Chinese Medicine tablets. 

Keywords Imaging technique; Rukuaixiao; Spatial distribution; Uniformity

（Received 30 June 2010; accepted 8 November 2010）

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文