3,4-二氨基苯基苯甲酮在基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析磷脂中的應(yīng)用

摘 要 考察了3，4-二氨基苯基苯甲酮（DABP）作為基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）新型基質(zhì)分析磷脂的能力。與傳統(tǒng)基質(zhì)2，4，6-三羥基苯乙酮（THAP）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）相比，用優(yōu)化后的DABP基質(zhì)溶液體系MeOH-H2O-HCl（80∶20∶3，V/V）分析不同種類的磷脂，可以有效抑制堿金屬離子加成現(xiàn)象，得到單一的質(zhì)子加成峰。樣品信號強(qiáng)，所需激光能量低，卵磷脂（PC）的檢出限可達(dá)到500 fmol。在實(shí)際樣品雞蛋和大豆提取物分析過程中，DABP基質(zhì)對磷脂分子具有良好的分辨率，碎片峰少，譜圖背景干凈，樣品制備方法簡單省時(shí)。

關(guān)鍵詞 基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜；基質(zhì)；3， 4-二氨基苯基苯甲酮；磷脂

1 引 言

脂類和磷脂分子，是除蛋白、核酸、多糖外的極其重要的生物大分子\\。它們不僅構(gòu)成了生物膜，還是細(xì)胞的脂類第二信使分子。脂類組學(xué)（Lipidomics）是近年來新提出的組學(xué)概念，可以定義為“確定細(xì)胞中的全部脂類種類以及所有脂類在脂類代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程、基因調(diào)控中的生物學(xué)作用”\\。采用高靈敏和高通量的技術(shù)手段，主要是質(zhì)譜技術(shù)，檢測脂類在生命過程中的系統(tǒng)變化，研究這些變化在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控、代謝等各種生命過程中的作用和規(guī)律。

基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）具有分析簡便迅速、樣品要求低、高靈敏度、高可重復(fù)性及抗雜質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白、多肽以及核酸的分析中，但在脂類分析領(lǐng)域中應(yīng)用較少。有證據(jù)表明，MALDI技術(shù)是脂類組學(xué)中分析脂類的有用工具，尤其是分析生物組織或細(xì)胞提取物的脂類組成\\。盡管MALDI技術(shù)發(fā)展日益成熟，但對于實(shí)際樣品的分析，合適基質(zhì)的選擇仍基于經(jīng)驗(yàn)的積累。DHB和CHCA在蛋白和多肽的分析上已經(jīng)被證明是較好的MALDI基質(zhì)，且DHB也被應(yīng)用于脂類分析中\\。此外，文獻(xiàn)\\以新的化合物為MALDI基質(zhì)，分析脂類。離子液體型MALDI基質(zhì)也被應(yīng)用于脂類分析，與傳統(tǒng)固體基質(zhì)DHB相比，可以提高樣品點(diǎn)的均勻性、信號強(qiáng)度及重現(xiàn)性\\。

與MALDI分析肽段時(shí)相比，分析脂類時(shí)堿金屬離子加成現(xiàn)象十分嚴(yán)重，影響脂類分子的定性和定量分析。另外，不同結(jié)構(gòu)的脂類分子存在質(zhì)量重疊，影響結(jié)構(gòu)鑒定\\。為了解決這些問題，常用薄層色譜（TLC）\\及高效液相色譜（HPLC）\\等技術(shù)對脂類樣品進(jìn)行預(yù)處理。但處理過程繁瑣，并會(huì)造成樣品損失。因此，選擇合適的基質(zhì)成為磷脂直接MALDI分析的關(guān)鍵。3，4-二氨基苯基苯甲酮（DABP）是一種既含有氨基又含有羰基的化合物，它在MALDI-TOF-MS分析中成功用于蛋白、多肽以及核酸的分析\\。本研究以DABP為基質(zhì)，用于磷脂的MALDI質(zhì)譜分析，系統(tǒng)考察了其分析磷脂的能力。結(jié)果表明，本方法不僅能降低堿金屬離子的加成，而且還能提高離子信號強(qiáng)度，增強(qiáng)樣品解吸離子化能力。DABP作為MALDI基質(zhì)分析磷脂具有可行性和良好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Autoflex飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）; DABP和THAP（美國Acros Organics公司）; CHCA和DHB（美國Sigma公司）; 卵磷脂（PC）、磷脂酸（PA）和磷脂酰蘇氨酸（PS）（美國Sigma公司）; 大豆磷脂軟膠囊（山東鴻洋神海洋生物技術(shù)有限公司）; 甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），HCl（優(yōu)級純，12 mol/L，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），其它試劑均為分析純。二次去離子水經(jīng)過Mill-Q水純化系統(tǒng)處理。雞蛋購于當(dāng)?shù)厥袌觥＊?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（PC， PA和PS）溶在氯仿-甲醇（50∶50，V/V）溶液中，超聲1 min， 終濃度為100

SymbolmA@ mol/L。蛋黃和卵磷脂膠囊中的脂類采用Folch方法提取\\。應(yīng)注意的是磷脂樣品溶液要配制在玻璃瓶中，以避免有機(jī)溶劑與塑料制品作用產(chǎn)生的分子影響質(zhì)譜分析\\。

DABP配制成20 mmol/L的甲醇-水（80∶20，V/V）溶液，并加入3%（V/V） HCl。THAP， DHB和CHCA配制成20 mmol/L的甲醇溶液。

樣品溶液與基質(zhì)溶液以1∶1（V/V）混合， 0.5

SymbolmA@ L混合溶液沉積在MALDI質(zhì)譜的靶上，自然干燥，置于質(zhì)譜儀器的離子源中進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2.3 MALDI-TOF MS分析

Autoflex飛行時(shí)間質(zhì)譜儀安裝有337 nm氮?dú)饧す庠础?shí)驗(yàn)中所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)都是在線性模式下得到的， 質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)采用外標(biāo)法進(jìn)行校正。每個(gè)質(zhì)譜圖為30次激光脈沖掃描累加圖。加速電壓范圍在－20 kV～＋20 kV。

3 結(jié)果與討論

3.1 DABP基體溶液體系的優(yōu)化

DABP分子量為212.25，在正離子檢測模式下，在m/z 212.9處的峰為\\＋峰，m/z424.3處為\\＋峰，m/z 407.4處為 \\＋峰。

離子化的基質(zhì)能更好地吸收激光能量，將其傳遞給樣品分子，使樣品分子獲得足夠的能量，信號強(qiáng)度不僅加強(qiáng)，而且由于所需激光能量降低，減少了分子碎片峰。因此，采用酸化法對DABP基質(zhì)溶液體系進(jìn)行離子化。在20 mmol/L DABP-甲醇溶液中，分別按體積比3% 加入12 mol/L HCl， 16 mol/L HNO3， 18 mol/L H2SO4和4 mol/L H3PO4溶液進(jìn)行酸化。

根據(jù)MALDI的原理，分析物首先與大量基質(zhì)分子混合，干燥后形成固體晶體。加入H3PO4和H2SO4酸化后，基質(zhì)和樣品混合溶液在靶子上未形成結(jié)晶，MALDI實(shí)驗(yàn)未觀察到樣品分子的信號。加入HNO3酸化后，樣品信號強(qiáng)度高，碎片峰明顯。在同等激光能量強(qiáng)度下，將DABP-甲醇溶液和加3%（V/V） HCl的DABP-甲醇溶液用于分析磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（DMPC，分子量677.94）， 見圖1。圖1b的樣品信號強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說明基質(zhì)溶液離子化確實(shí)能增強(qiáng)樣品信號強(qiáng)度。

考慮到基質(zhì)溶液體系中水的存在使點(diǎn)樣時(shí)溶液容易形成液滴直接點(diǎn)在靶子上，這樣槍頭不易碰到靶子上影響結(jié)晶； 圖1 不同的DABP溶液體系對磷脂樣品（DMPC，分子量677.940）分析的MALDI質(zhì)譜圖

Fig．1 MALDI mass spectra of 1，2-dimycistoyl-sn-glycero-3 （DMPC）（MW＝677.940）

a. diaminobenzophenone (DABP) in methanol solution; b. 3% HCl acidification of DABP in methanol solution as matrices

但若水含量太多，將會(huì)延長干燥時(shí)間，導(dǎo)致不均相的結(jié)晶，影響質(zhì)譜分析\\。因此，水的比重以20%左右為宜，經(jīng)過優(yōu)化的DABP體系中的溶液組成為MeOH-H2O-HCl（80∶20∶3，V/V）。

3.2 正離子模式下對不同種類磷脂的比較分析

在線性正離子模式下，對4種不同的基質(zhì)DABP， THAP， DHB和CHCA對磷脂樣品（DMPC，分子量677940）進(jìn)行比較分析，得到的MALDI質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖2 線性正離子模式下， 4種不同的基質(zhì)對磷脂樣品（DMPC，分子量677.940）的MALDI質(zhì)譜圖

Fig．2 MALDI mass spectra of DMPC（MW＝677.940） in linear positive ion mode using different matrices

a. DABP; b. 2，4，6-trihydroxy-acetophonone（THAP）; c. 2，5-dihydroxy-benzoic acid（DHB）; d. α-cyano-4-hyolroxycinnamic acid（CHCA）. *: the peaks from DABP matrix are marked with asterisks

圖2a中只有單一的\\＋峰，基質(zhì)背景峰少。圖2b中出現(xiàn)了明顯的\\＋峰，圖2c及圖2d中出現(xiàn)了\\＋峰和\\＋峰。

圖3是對3種PC（DMPC，MW＝677.94；DPPC，MW＝734.05；DOPC，MW＝786.15）、PA的鈉鹽（MW＝670.88） 和PS的鈉鹽（MW＝757.96）混合樣品進(jìn)行分析的MALDI質(zhì)譜圖。

圖3 不同基質(zhì)對3種PC（DMPC， DPPC， DOPC）、PA的鈉鹽和PS的鈉鹽的混合樣品的MALDI質(zhì)譜圖

Fig．3 In linear positive ion mode MALDI mass spectra of a mixture of five phospholipids of DMPC（MW＝677.94）， DPPC（MW＝734.05）， 1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DOPC，MW＝786.15）， 1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate（DPPA，sodium salt， MW＝670.88） and 1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-\\（DPPS，monosodium salt， MW＝757.96） using different matrices

a. DABP; b. THAP; c. DHB.在線性正離子模式下，無論采用何種基質(zhì)，PC的信號都完全抑制了PA和PS的信號\\。但從譜圖質(zhì)量來看，以DABP為基質(zhì)時(shí)，每種PC樣品的信號峰都只有單一的\\＋峰，成功抑制堿金屬加成峰。信噪比均大于100，分辨率都大于1500。圖3b和3c中出現(xiàn)了信號較強(qiáng)的\\＋及\\＋峰。

3.3 負(fù)離子模式下對不同種類磷脂的分析

強(qiáng)酸性磷脂（如磷脂酸PA）有2個(gè)負(fù)電荷。因此，若帶1個(gè)正電荷，且在正離子模式下被檢測到，共需要3個(gè)正電荷，十分困難\\。磷脂酰絲氨酸PS也是一種酸性磷脂，正離子模式下信號較弱，更適合在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析。將DPPA的鈉鹽（MW＝670.88）和DPPS的鈉鹽（MW＝757.96）的混合物用優(yōu)化后的DABP基質(zhì)溶液在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析，得到圖4a。酸性磷脂鈉鹽失去Na＋，均得到單一的\\－峰，分辨率高。

由圖4b可見PA（m/z 648.25）和PS（m/z 735.37）的信號峰，而PC 的信號峰強(qiáng)度不僅弱，且發(fā)生了偏

圖4 在線性負(fù)離子模式下磷脂混合樣品的MALDI質(zhì)譜圖

Fig．4 MALDI mass spectra of a phospholipids mixture in linear negative ion mode using DABP as a matrix

a. DPPA and DPPS; b. DMPC， DPPC， DOPC， DPPA and DPPS．

移。所以對復(fù)雜樣品的分析，基于不同種類磷脂分離的前處理十分必要。

3.4 不同種類磷脂的檢測限

針對不同種類的磷脂，使用不同種類的基質(zhì)進(jìn)行MALDI分析時(shí)的檢出限如表1所示。PC在正離子模式下檢測，PA和PS均在負(fù)離子模式下檢測。DABP基質(zhì)分析磷脂時(shí)可以獲得相當(dāng)甚至更低的檢出限，而且DABP檢測PC時(shí)，由于成功抑制了堿金屬加成峰，樣品峰的分辨率也高于其它譜圖。

3.5 對實(shí)際樣品的分析

蛋黃和大豆中都含有豐富的磷脂，按照實(shí)驗(yàn)方法處理后，將富含脂類的有機(jī)相進(jìn)行MALDI分析。

根據(jù)文獻(xiàn)\\，蛋黃主要含有以下磷脂：卵磷脂（PC， 73%）， 磷脂酰乙醇胺（PE， 15.0%）， 溶血卵磷脂（LPC， 5.8%）， 鞘磷脂（SM， 2.5%）， 溶血磷脂酰乙醇胺（LPE， 2.1%） 及磷脂酰肌醇（PI， 0.6%）。氯仿/甲醇提取物主要含有極性磷脂，如卵磷脂\\。

蛋黃溶液提取物MALDI質(zhì)譜圖如圖5a所示，可以看出主要都是PC的峰，這一方面由于PC含量高，另一方面是PC抑制了其它種類磷脂的解析離子化。最強(qiáng)峰在m/z 760.85，是PC 16∶0-18∶1的\\＋峰。而采用其它基質(zhì)分析時(shí)，PC 16∶0-18∶1 在m/z 760.85和782.85產(chǎn)生\\＋峰和\\＋峰。但是m/z 782.85 可以是PC 16∶0-20∶4的\\＋峰。因此， 很難判斷m/z 782.85峰是PC 16∶0-20∶4的\\＋峰，還是PC 16∶0-18∶1的\\＋峰。用DABP基質(zhì)時(shí)，m/z 782.85峰可以檢測到，說明是PC 16∶0-20∶4的\\＋峰。從中可以看出抑制堿金屬加成峰對于復(fù)雜脂類樣品分析的重要性。根據(jù)譜圖顯示，參考蛋黃卵磷脂PC一般含有的脂肪酸含量分布：16∶0（34%）， 16∶1（1%）， 18∶0（10%），18∶1（31%）， 18∶2（17%）， 20∶4（3%）\\以及樣品峰的質(zhì)荷比，在網(wǎng)站 （http∶//www.lipidmaps.org/）上進(jìn)行查詢，鑒定出來的PC脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)見表2。圖5 正離子模式下優(yōu)化后的DABP基質(zhì)溶液對（a）蛋黃溶液提取物和（b）大豆卵磷脂提取物進(jìn)行MALDI分析的質(zhì)譜圖

Fig．5 In positive ion mode MALDI mass spectra of（a）egg yolk extract and（b） soybean lecithin extract using DABP as a matrix

對大豆卵磷脂膠囊的脂類提取物進(jìn)行MALDI分析，得到圖4b。主要峰對應(yīng)的磷脂分子結(jié)構(gòu)如表3所示。可以明顯看出，植物中含有的不飽和脂肪酸比例高于動(dòng)物。對于m/z 784.65和786.66 的峰，單純從一級質(zhì)譜圖上無法確定脂肪酸鏈的結(jié)構(gòu)，需要采用多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

以上結(jié)果表明，以DABP為基質(zhì)對磷脂進(jìn)行分析具有明顯的優(yōu)勢：（1）成功抑制堿金屬加成峰；（2）譜圖背景干凈，樣品碎片峰少；（3）檢出限低，分辨率高；（4）樣品信號強(qiáng)，需要的激光能量低。因此可以廣泛應(yīng)用于磷脂樣品MALDI質(zhì)譜分析中。

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Matrix of 3，4- Diaminobenzophenone for Analysis of Phospholipids by

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of

Flight-Mass Spectrometry



MIAO Nan1， ZHANG Yu1， ZHANG Jian-Ye1，2，ZOU Han-Fa1

1（Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023）

2（Department of Chemistry， Zhengzhou University， Zhengzhou 450052）

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Abstract The matrix of 3，4-diaminobenzophenone（DABP） was applied in the analysis of phospho-lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The optimal composition of DABP matrix solution with methanol-water-hydrochloric acid（80∶20∶3， V/V） was used in the analysis of different phospholipids species by comparing with the conventional matrices such as 2，4，6-trihydroxyacetophenone（THAP）， 2，5-dihydroxy-benzoic acid（DHB） and α-cynao-4-hydroxycinnamic acid（CHCA）， 3，4-diamino-benzophenone（DABP） can effectively suppress alkali metal ion adducts， thus showing single peak of phospholipids with low laser energy and strong peak strength. 500 fmol phosphatidylcholines（PCs） can be detected with high signal to noise ratio. With DABP as a matrix for the analysis of egg yolk and soybean extracts， intact phospholipids ion peaks can be readily produced with clean spectrum background and high resolution. In addition， the sample preparation method is simple and time-saving. 

Keywords Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; Matrix; 3，4-Diaminobenzophenone; Phospholipids

（Received 16 August 2010; accepted 7 December 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文