集在線熒光分析的連續(xù)流動反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應快速擴增檢測食源致病性輪狀病毒

摘 要 采用含RNA反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription，RT）和在線熒光分析的連續(xù)流動聚合酶鏈式反應（Poly-merase chain reaction，PCR）微流控技術(shù)檢測食源致病性輪狀病毒。此RT-PCR微流控裝置以加熱銅塊組成恒溫帶，以聚四氟乙烯毛細管微通道為反應體系構(gòu)建而成。采用循環(huán)水冷卻退火區(qū)，此裝置能獲得低至31 ℃的退火溫度，而且溫度控制及其穩(wěn)定性良好，因而能滿足不同PCR的要求。為了充分體現(xiàn)PCR微流控技術(shù)的優(yōu)越性，在線熒光分析被用于檢測PCR產(chǎn)物。當流速為7.5 mm/s時，輪狀病毒RNA的cDNA擴增和在線熒光分析能在約12 min完成（擴增約10 min，在線分析約2 min）。在此集成化的RT-PCR微流控裝置上，1 h可完成輪狀病毒RNA的RT-PCR以及其擴增產(chǎn)物的在線熒光分析，樣品檢出限達到6.4×104 copies/

@ L。

關(guān)鍵詞 連續(xù)流動反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應； 在線熒光分析； 微流控技術(shù)； 食源致病性輪狀病毒

1 引 言

胃腸炎是人類最常見的一種疾病。大多數(shù)胃腸炎是由病毒引起，其中輪狀病毒是最主要的病原體之一。在感染輪狀病毒人群中，嬰幼兒成為主要群體，其中多數(shù)表現(xiàn)為嚴重急性腹瀉，全球每年由此造成約60萬5歲以下兒童死亡，其中80%以上在發(fā)展中國家。在我國，每年秋冬季是嬰幼兒腹瀉的高發(fā)期，這些病例中40%～60%是由輪狀病毒引起。輪狀病毒主要通過糞-口途徑傳播，隨糞便排出體外后進入水體環(huán)境，在生活污水以及受污染地表水中廣泛存在。它對水環(huán)境安全以及人類健康已構(gòu)成嚴重威脅。因此，建立準確快速的檢測方法具有重要意義。

目前，檢測輪狀病毒的方法有電鏡觀察、細胞培養(yǎng)、核酸雜交、酶聯(lián)免疫及聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction， PCR）。電鏡觀察具有直接、可靠等優(yōu)點。它可分為超薄切片法、負染法以及免疫電鏡法。前兩者方法操作復雜、費時、敏感性低，需要的病毒量較多。免疫電鏡法是一種高度精確、靈敏的方法，但是其操作過程復雜，且價格昂貴。對于細胞培養(yǎng)法，其操作過程復雜、所需時間長、特異性不強。目前，快速靈敏的分子生物學方法已用于輪狀病毒檢測，主要是反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR， RT-PCR）。為了提高檢測靈敏度和特異性或者檢測通量，經(jīng)典RT-PCR已經(jīng)發(fā)展成RT-巢式-PCR（RT-nested-PCR）、實時定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）以及多元RT-PCR（Multiplex RT-PCR）。然而，這些RT-PCR一般都在傳統(tǒng)PCR儀上進行。傳統(tǒng)PCR通常存在熱容較大、熱循環(huán)時間長、能量消耗高、空間體積大、集成化程度低等不足。微流控PCR自20世紀90年代初就已經(jīng)引起人們關(guān)注，并且在核酸擴增分析領(lǐng)域日益受到重視。

微流控PCR可分為兩種結(jié)構(gòu)形式：微池靜態(tài)PCR和連續(xù)流動PCR。前者是傳統(tǒng)PCR微縮化，反應液固定在微反應池中，反應時間和能量消耗仍受系統(tǒng)熱容所限制。為了取得較快的熱循環(huán)速度和較小的能量消耗，系統(tǒng)熱容通常需要精確優(yōu)化。在連續(xù)流動PCR中，反應液在微通道中連續(xù)流動，往復通過2或3個恒溫區(qū)，從而實現(xiàn)快速熱循環(huán)擴增。連續(xù)流動PCR可分為下面幾種：蛇型通道單向流PCR、直通道振蕩流PCR、平面/柱面上螺旋通道單向流PCR以及閉合圓環(huán)通道單向流PCR。前兩種連續(xù)流動PCR的溫度帶布置一般為：高溫解鏈→中溫延伸→低溫退火，具有平滑的溫度梯度優(yōu)點，但是已解鏈的單鏈DNA經(jīng)過延伸溫度區(qū)時可能會與模板鏈或者其互補鏈結(jié)合形成雙鏈而降低PCR效率。如果按照高溫解鏈→低溫退火→中溫延伸布置時，在退火區(qū)將會需要強制性冷卻而不是加熱，這樣會使系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜。3個溫度帶呈圓形布置能成功解決該問題。然而，3個溫度帶呈圓形布置的螺旋通道或者閉合圓環(huán)通道單向流PCR中，很少將RNA反轉(zhuǎn)錄以及在線熒光分析集成到連續(xù)流動PCR中。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，將RNA反轉(zhuǎn)錄和在線熒光分析兩個單元功能集成到3個溫度帶呈圓形布置的螺旋通道連續(xù)流動PCR中，從而形成集RNA反轉(zhuǎn)錄、連續(xù)流動PCR擴增及在線熒光檢測于一體的微流控裝置，在該裝置上成功進行了糞便中輪狀病毒RNA的快速擴增檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Mastercycler Gradient PCR儀和Biophotometer 生物分光光度計（德國Eppendorf公司）；KDS210注射泵（美國KD Scientific公司）；Gel Doc XR凝膠成像分析儀和M17熒光顯微鏡（美國Bio-rad公司）；熒光顯微鏡的濾光片選擇EF450-490 （BP470）、BF520和DM505；冷卻式CCD相機（廣州明美科技有限公司）；聚四氟乙烯（PTFE）毛細管（內(nèi)徑0.5 mm，外徑0.9 mm，無錫市祥健四氟制品有限公司）。

5×M-MLV 緩沖液 （375 mmol/L KCl，250 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），15 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 （RNase H-，200 U/

@ L）、RNases抑制劑 （40 U/

@ L）、10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 （500 mmol/L KCl， 100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3）， 15 mmol/L MgCl2）、Taq DNA聚合酶 （5 U/

@ L）、脫氧核糖核苷酸（dNTPs） （其中dATP、dGTP、dCTP和dTTP濃度均為2.5 mmol/L）購自寶生物工程（大連）有限公司；雙重去離子水（ddH2O，天根生化科技（北京）有限公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，生工生物工程（上海）有限公司）；根據(jù)輪狀病毒高保守區(qū)段VP7基因設(shè)計的引物（P1/P2（5′-3′）：GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG/ GATCCTGTTGGCCATCC）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，擴增的靶片段為392 bp；輪狀病毒陽性糞便樣品由廣州華僑醫(yī)院提供，并用TRIzol法從中抽提病毒RNA，在生物分光光度計上測量其濃度和純度；小牛血清蛋白（BSA）（組分 V，純度>98％，德國羅氏公司）；GoldViewTM和SYBR Green I染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；DL 2000 DNA標準分子（廣州盈信南方生物技術(shù)有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 集成化的連續(xù)流動PCR微流控裝置 連續(xù)流動RT-PCR-在線熒光分析裝置示意圖見圖1。它由實驗室自行設(shè)計的基于LabView的溫度控制與采集系統(tǒng)、RT/PCR加熱銅圓柱體（75 mm×3.5 mm i.d.）、4條微型K型熱電偶、4根銅圓柱體加熱的電阻加熱棒（Φ 12 mm（RT）或6 mm （PCR），長60 mm，功率100 W，廣州豪怡電熱電器廠）、熒光顯微成像系統(tǒng)、計算機、以及注射泵等構(gòu)成。在LabView 8.0運行的模糊比例/積分/微分（PID）控制策略下，溫度控制與采集系統(tǒng)能精確控制RT所需溫度（42 ℃）以及PCR所需3個溫度（即解鏈溫度95 ℃、退火溫度50 ℃以及延伸溫度72 ℃）。RT加熱銅圓柱體中心處有一個Φ12 mm通孔用于放置電阻加熱棒，而通孔附近處小孔（10 mm×1 mm i.d.）用于包埋熱電偶。PCR加熱銅圓柱體被切割成3塊（放置電阻加熱棒的中心通孔Φ 6 mm，而其附近處包埋熱電偶小孔10 mm×1 mm i.d.），在一定流速下解鏈、退火以及延伸反應時間比為1∶1∶2。

RT和PCR的PTFE毛細管包埋在各自銅圓柱體的螺旋溝槽（寬1.1 mm，深1.1 mm）中。連續(xù)流動RT區(qū)毛細管長度為5.5 m；連續(xù)流動PCR區(qū)毛細管長度約為5 m，構(gòu)成40個熱循環(huán)。為有利于雙鏈DNA初始解鏈以及最后延伸反應，在第一個及最后一個循環(huán)中分別使毛細管通過橫穿于退火/延伸區(qū)的通孔（Φ 1.5 mm）以及退火區(qū)的通孔（Φ 1.5 mm）。另外，一股冷卻循環(huán)水通過退火區(qū)加熱銅柱體的通孔，以穩(wěn)定獲取退火溫度。

圖1 具有RNA反轉(zhuǎn)錄-在線熒光分析的連續(xù)流動PCR微流控裝置示意圖

Fig．1 Schematic diagram of continuous-flow PCR microfluidics integrated with reverse transcription （RT） of ribonucleic acid（RNA） and online fluorescence analysis

2.2.2 連續(xù)流動RT反應和連續(xù)流動PCR反應 在連續(xù)流動RT中，10

@ L混合物中含6.4×107 copies/

@ L RNA樣品、1×M-MLV 緩沖液、0.5 mmol/L dNTP、1

@ mol/L P1/P2引物、2.0 U/

@ L RNases抑制劑、10 U/

@ L M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及0.25 g/L BSA。當RT銅圓柱體溫度維持42 ℃和溶液流速為2.0 mm/s時，連續(xù)流動RT反應時間約為45 min。陽性控制RT采用相對應RT混合物在傳統(tǒng)PCR儀上進行，程序設(shè)定為：RT反應在42 ℃下進行60 min，溫度上升到75 ℃，并維持20 min，以防止非特異性結(jié)合。

樣品RNA經(jīng)過RT反應合成cDNA后，2

@ L cDNA作為PCR模板。25

@ L連續(xù)流動PCR混合物中含有1×Taq DNA 聚合酶緩沖液、0.2 mmol/L dNTP， 0.4

@ mol/L P1/P2引物， 1×SYBR Green I， 0.1 U/

@ L Taq DNA聚合酶及0.25 g/L BSA。PCR混合物引入到毛細管微通道后，在注射泵驅(qū)動下實現(xiàn)連續(xù)流動PCR。陽性控制PCR采用相對應PCR混合物在傳統(tǒng)PCR儀上進行，其程序為：在94 ℃下初始解鏈3 min；循環(huán)（94 ℃，30 s；50 ℃，30 s；72 ℃ 60 s）40次；在72 ℃下延伸反應3 min。整個PCR所需時間約95 min。

2.2.3 一步連續(xù)流動RT-PCR反應 對于一步連續(xù)流動RT-PCR，20

@ L反應混合物中含有一定濃度RNA樣品、1×Taq DNA 聚合酶緩沖液、0.5 mmol/L dNTP、0.4

@ mol/L P1/P2引物、1×SYBR Green I、2.0 U/

@ L RNases抑制劑、10 U/

@ L M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.2 U/

@ L Taq DNA聚合酶及0.25 g/L BSA。反應混合物在連續(xù)流動RT過程中流速為2.0 mm/s，而在連續(xù)流動PCR過程中流速為3.5 mm/s。連續(xù)流動RT-PCR檢出限通過擴增檢測反應混合物中不同濃度（640～6.4×108 copies/

@ L）的輪狀病毒RNA實現(xiàn)。一步RT-PCR陽性控制實驗在傳統(tǒng)PCR儀上進行：在42 ℃下RT反應60 min；升溫至94 ℃下初始解鏈3 min；循環(huán)（94 ℃，30 s；50 ℃，30 s；72 ℃ 60 s）40次。整個RT-PCR所需時間約150 min。

2.2.4 PCR產(chǎn)物分析 在毛細管出口處的適當位置進行產(chǎn)物的在線熒光分析，熒光顯微鏡的采集圖像通過MS 1.0軟件（廣州明美科技有限公司）分析。另外，0.2 mL PCR試管也用于接取產(chǎn)物，于4 ℃冷藏，以便作進一步的離線瓊脂糖凝膠電泳分析。取5

@ L 產(chǎn)物，加入1

@ L 6×溴酚藍上樣液均勻混合； 加樣到1.5%（w/V）的瓊脂糖（含GoldViewTM染料， 20 mL瓊脂糖溶液中加1.0

@ L GoldViewTM染料）上樣孔中，電泳緩沖液為1×TAE，在5 V/cm電場下電泳約30 min，在凝膠成像分析儀上判斷PCR結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 連續(xù)流動RT-PCR微流控裝置的溫度控制及其穩(wěn)定性

PCR是一個典型的溫度控制的酶促生化反應，特征溫度包括解鏈溫度、退火溫度及延伸溫度，其中退火溫度是影響PCR特異性甚至成功與否的重要因素。在螺旋通道單向流PCR中，多采用空氣溝槽或者熱絕緣片來防止溫度區(qū)之間的熱交互干擾。空氣溝槽設(shè)計相對簡單，但是裝置結(jié)構(gòu)不緊湊、甚至難以獲得低的退火溫度（如37 ℃）。基于薄絕緣片的熱絕緣方法中每個溫度塊需要空氣冷卻，裝置相對復雜、風冷裝置體積較大。

本實驗采用循環(huán)水冷卻方式。本設(shè)計的主要優(yōu)點：（1）循環(huán)水冷卻僅僅發(fā)生于退火區(qū)上的通孔，加工簡單；（2）水循 圖2 循環(huán)水冷卻對連續(xù)流動PCR溫度控制和均一性的影響

Fig．2 Effect of circulating water cooling on the temperature control and uniformity of continuous-flow PCR

1. 解鏈區(qū)溫度（The temperature of denaturation zone）；

2. 延伸區(qū)溫度（The temperature of extension zone）；

3. 無循環(huán)水冷卻的退火區(qū)溫度（The temperature of annealing zone， without the circulation water cooling on this zone）；4.循環(huán)水冷卻的退火區(qū)溫度（The temperature of annealing zone， with the circulation water cooling on this zone）。環(huán)通過微型泵驅(qū)動，附屬水冷卻裝置整體結(jié)構(gòu)較緊湊；（3）能獲得相當?shù)偷耐嘶饻囟龋瑵M足不同PCR要求。在目前微流控裝置上，當解鏈和延伸區(qū)分別加熱至95 ℃和72 ℃（退火區(qū)不加熱）時，在無循環(huán)水冷卻情況下，經(jīng)過30 min退火區(qū)溫度逐漸上升至52.5 ℃；相反，在循環(huán)水冷卻情況下，經(jīng)過10 min后退火區(qū)溫度穩(wěn)定維持在31 ℃。因此，通過循環(huán)水冷卻退火區(qū)，微流控裝置能獲得低至31 ℃的退火溫度（環(huán)境溫度為（25±1）℃）。相似地，當退火區(qū)加熱且溫度設(shè)定為50 ℃時，在無循環(huán)水冷卻條件下經(jīng)過約1.5 min后退火區(qū)溫度達到50 ℃。然而，盡管解鏈和延伸區(qū)溫度分別穩(wěn)定于95 ℃和72 ℃（圖2中曲線1和曲線2）， 但是退火區(qū)溫度并不穩(wěn)定，實際的退火區(qū)溫度能升至約54 ℃（圖2中曲線3）， 不能滿足連續(xù)流動PCR要求。相反，當循環(huán)水冷卻退火區(qū)時，連續(xù)流動PCR退火溫度也能在較短時間內(nèi)升至50 ℃，而且相當穩(wěn)定。在這種情況下，解鏈和延伸區(qū)的溫度上升軌跡與無循環(huán)水冷卻退火區(qū)時相似。因此，通過循環(huán)水冷卻退火區(qū)，連續(xù)流動PCR不僅結(jié)構(gòu)緊湊，而且溫度控制相當穩(wěn)定。

3.2 連續(xù)流動RT合成輪狀病毒RNA的cDNA

當連續(xù)流動RT-PCR檢測食源致病性輪狀病毒時，通過連續(xù)流動RT將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA是至關(guān)重要的。實驗中，通過兩步RT-PCR評價毛細管微通道中連續(xù)流動RT的性能。圖3是在微流控裝置和傳統(tǒng)PCR儀上RNA的RT反應及cDNA 的PCR反應。從圖3可見：（1）兩步連續(xù)流動RT-PCR能成功擴增檢測輪狀病毒RNA（圖3中條帶2）；（2）當RT和PCR都在連續(xù)流動微反應器中進行時，其擴增條帶亮度（圖3中條帶2）暗于其中一個過程（圖3中條帶1和3）或者兩個過程（圖3中條帶4）都在傳統(tǒng)PCR儀上進行時的亮度，

這可能因為毛細管微通道對RT及PCR的表面抑制效應。本實驗用0.25 g/L BSA 對毛細管內(nèi)圖3 連續(xù)流動PCR微反應器和傳統(tǒng)PCR儀上兩步式RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig．3 Gel electrophoresis of two-step reverse transcription(RT)-PCR products using continuous-flow PCR microreactors and conventional PCR amplifier

M. DNA標準分子量（DNA marker）；1. 連續(xù)流動RT反應器中合成cDNA，在傳統(tǒng)PCR儀上進行靶片段的擴增; 2. 微流控裝置上進行兩步式RT-PCR; 3. 傳統(tǒng)PCR儀上合成cDNA，然后在連續(xù)流動PCR微流控裝置上進行靶片段的擴增; 4. 傳統(tǒng)PCR儀上進行兩步式RT-PCR; 5. 微流控裝置上進行兩步式RT-PCR陰性控制反應，RT-PCR溶液中無RNA樣品。1. cDNA was synthesized using continuous-flow RT reactor and then amplified by conventional PCR amplifier； 2. Two-step RT-PCR was performed on the microfluidic device； 3. cDNA was synthesized by the conventional PCR amplifier and then amplified using the continuous-flow PCR microreactor； 4. Two-step RT-PCR was accomplished by the conventional PCR amplifier； 5. Negative-control two-step RT-PCR was performed， without RNA sample in the RT-PCR solution.表面進行靜力學和動力學鈍化，以減少這種不利效應。然而，從實驗結(jié)果可以看出：進一步減輕這種不利的表面效應也許需要將基于BSA的鈍化技術(shù)與其它鈍化技術(shù)（如內(nèi)表面硅烷化處理）聯(lián)合使用。

3.3 集在線熒光分析的連續(xù)流動PCR快速擴增檢測輪狀病毒RNA的cDNA

對于連續(xù)流動PCR，可通過改變?nèi)芤涸谖⑼ǖ乐械牧魉僬{(diào)整PCR熱循環(huán)速度，從而實現(xiàn)快速PCR。圖4A是當線性流速從2.0 mm/s增大到10.0 mm/s時，在線熒光分析連續(xù)流動PCR產(chǎn)物的結(jié)果；圖4B是對應的連續(xù)流動PCR產(chǎn)物以及傳統(tǒng)PCR儀上陽性控制PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。連續(xù)流動PCR產(chǎn)物的數(shù)量隨流速的增加而逐漸減少，但是PCR的熱循環(huán)速度逐漸增快。線性流速為2.0 mm/s（延伸時間為22.5 s），40個連續(xù)流動PCR循環(huán)所需時間約為45 min，線性流速為10.0 mm/s（延伸時間為4.5 s）時約需9 min。然而，它的最大熱循環(huán)速度則受Taq 聚合酶的動力學所控制（即受延伸時間所控制）。在72 ℃時Taq 聚合酶的延伸速率約為60～100 bp/s。為了成功擴增392 bp的靶片斷，延伸時間通常要大于6 s（圖4A中流速2.0、3.5、5.0及7.5 mm/s；圖4B中條帶3～6）；延伸時間少于6 s 則擴增效果不理想，甚至失敗（圖4A中流速10.0 mm/s；圖4B中條帶2）。本實驗中，當流速為7.5 mm/s，輪狀病毒RNA的cDNA能在約12 min內(nèi)完成擴增和檢測（擴增大約需10 min，圖4A中流速7.5 mm/s），比傳統(tǒng)PCR擴增和離線瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖4B中條帶1）快十多倍。因此，集在線熒光分析的連續(xù)流動PCR微流控裝置能快速擴增檢測輪狀病毒RNA的cDNA。

圖4 PCR溶液流速對連續(xù)流動PCR影響 （在線熒光分析（A）和凝膠電泳分析（B））

Fig．4 Effect of flow rates of PCR solution on continuous-flow PCR （online fluorescence analysis （A）and gel electrophoresis analysis （B））

M. DNA標準分子量（DNA marker）；1. 傳統(tǒng)PCR儀上陽性控制PCR；2～6. 線性流速分別為10， 7.5， 5.0， 3.5及2.0 mm/s條件下進行連續(xù)流動PCR擴增；7. 微流控裝置上陰性控制PCR， 流速為 5.0 mm/s，PCR溶液中無cDNA樣品。1. Positive-control PCR product was performed from conventional PCR amplifier; 2～6. Continuous-flow PCR was performed at different flow rates of 10， 7.5， 5.0， 3.5 and 2.0 mm/s， respectively; 7. Negative-control PCR was performed on the microfluidics at 5.0 mm/s of flow rate， without cDNA sample in PCR solution.

3.4 集在線熒光分析的一步連續(xù)流動RT-PCR擴增檢測輪狀病毒RNA

圖5A是當RNA濃度從6.4×108 copies/

@ L依次變化到6.4×102 copies/

@ L時，在線熒光分析連續(xù)流動RT-PCR產(chǎn)物的結(jié)果；圖5B是對應的連續(xù)流動RT-PCR產(chǎn)物以及傳統(tǒng)PCR儀上陽性控制RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物數(shù)量隨著輪狀病毒RNA濃度降低而逐漸減少；微流控裝置的檢出限為6.4×104 copies/

@ L。Kou等基于傳統(tǒng)多元RT-PCR法，檢測牡蠣中輪狀病毒的檢出限約為8×104 copies/

@ L。因此，微流控裝置的檢出限達到甚至低于在傳統(tǒng)PCR儀上所獲得的檢出限，也接近甚至低于普通電鏡觀察法通常所能達到的檢出限（普通電鏡觀察法大于107病毒顆粒數(shù)/mL；免疫電鏡法為104～105病毒顆粒數(shù)/mL）。如前所述，毛細管微通道對RT和PCR具有表面抑制效應，降低了反應效率，從而使RNA擴增檢出限升高，改善不利的表面效應也許能進一步降低擴增檢出限。本實驗采用1×Taq DNA 聚合酶緩沖液進行一步連續(xù)流動RT-PCR反應，因此反轉(zhuǎn)錄酶和/或Taq聚合酶也許具有不協(xié)調(diào)的酶反應緩沖液條件，從而升高了擴增檢出限。

圖5 連續(xù)流動微流控裝置上一步式RT-PCR擴增檢測不同濃度的病毒RNA（在線熒光分析（A）和凝膠電泳分析（B））

Fig．5 Amplification and detection of different concentrations of input virus RNA by one-step RT-PCR on the continuous-flow microfluidic device（online fluorescence analysis（A）and gel electrophoresis analysis（B））

M. DNA標準分子量（DNA marker）； 1. 傳統(tǒng)PCR儀上陽性控制RT-PCR，RNA濃度為6.4×107 copies/

@ L； 2～8. 連續(xù)流動一步式RT-PCR擴增檢測時病毒RNA濃度依次從6.4×108 copies/

@ L變化到6.4×102 copies/

@ L；9. 連續(xù)流動一步式RT-PCR陰性控制，RT-PCR溶液中無RNA樣品， 流速為 5.0 mm/s。1. Positive-control RT-PCR was performed on conventional PCR machine， the concentration of input virus RNA was 6.4×107 copies/

@ L ； 2-8. During amplification and detection by continuous-flow one-step RT-PCR， concentrations of input virus RNA ranged from 6.4×108 to 6.4×102 copies/

@ L； 9. Negative-control continuous-flow one-step RT-PCR was performed at 5.0 mm/s of flow rate without RNA sample in the RT-PCR solution。

4 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明：（1）本裝置不僅設(shè)計結(jié)構(gòu)緊湊，而且其溫度控制穩(wěn)定，能取得很低的退火溫度；（2）用0.25 g/L BSA 對毛細管內(nèi)表面進行靜力學和動力學鈍化，但毛細管內(nèi)表面對連續(xù)流動RT以及PCR仍具有不利的表面效應，因此建議將基于BSA鈍化技術(shù)與其它鈍化技術(shù)（如內(nèi)表面硅烷化處理）聯(lián)合使用；（3）微流控裝置能快速擴增檢測輪狀病毒。輪狀病毒RNA的cDNA擴增和檢測能在12 min內(nèi)完成，比傳統(tǒng)PCR和離線瓊脂糖凝膠電泳檢測速度快得多；（4）輪狀病毒RNA的一步連續(xù)流動RT-PCR擴增檢出限達到6.4×104 copies/

@ L。為了進一步降低檢出限，可嘗試將連續(xù)流動RT-PCR與其它高靈敏度的檢測方法相結(jié)合，如電化學發(fā)光、激光誘導熒光及毛細管電泳。



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Rapid Amplification and Detection of Foodborne Pathogenic Rotavirus by

Continuous-flow Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Integrated with Online Fluorescence Analysis



ZHANG Chun-Sun， LI Yu-Yuan， WANG Hai-Ying

（Ministry of Education Key Laboratory of Laser Life Science and Institute of Laser Life Science，

South China Normal University， Guangzhou 510631）



Abstract A continuous-flow polymerase chain reaction （PCR） microfluidics integrated with reverse transcription （RT） of RNA and online fluorescence analysis has been introduced， which has been successfully applied for fast amplification and identification of foodborne pathogenic Rotavirus. On this continuous-flow RT-PCR device， the isothermal heating copper blocks provides the temperatures for RT-PCR， and the polytetrafluoroethylene （PTFE） capillary was used as the RT-PCR reaction channel. By using the cycling water to cool the annealing zone， the annealing temperature as low as 31 ℃ could be obtained for the presented device， where good temperature control and stability was also achieved.Therefore， this device can meet different PCR requirements. To make the best of the advantages of microfluidic PCR， the online fluorescence analysis of amplification products has been performed. When the flow rate of 7.5 mm/s was used， the amplification of cDNA synthesized from Rotavirus RNA and then the online fluorescence analysis of amplification products could be completed in about 12 min （ about 10 min for amplification and 2 min for analysis）.By using this microfluidic device， the RT-PCR of Rotavirus RNA and the online fluorescence analysis of its products can be accomplished within 1 h or so， and as well the detection limit of the RNA concentration is 6.4×104 copies/

@ L.

Keywords Continuous-flow reverse transcription-polymerase chain reaction； Online fluorescence analysis; Microfluidics; Foodborne pathogenic rotavirus

（Received 30 September 2010; accepted 27 December 27）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文