基于發光金納米粒子熒光增強法測定溶菌酶

摘 要 參照文獻方法合成了BSA修飾的水溶性發光金納米粒子，并考察了其與溶菌酶之間的相互作用。依據溶菌酶對金納米粒子的發光增強現象，建立了測定溶菌酶的熒光新方法?？疾炝税l光金納米粒子的濃度、pH值、反應時間及共存物質對測定的影響。優化條件為：發光金納米粒子濃度4.0 ×10－6 mol/L、pH 7.0、反應時間 10 min。在此條件下，熒光增強與溶菌酶濃度在2×10－7～8×10－6 mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限為3.0×10－8 mol/L。對4.0 ×10－6 mol/L溶菌酶平行測定6次，相對標準偏差為2.6%。本方法具有靈敏度高、探針水溶性好和生物毒性低的優點，同時，常見低等電點蛋白質對分析不干擾。本方法用于合成樣品及雞蛋清中溶菌酶含量測定，平均回收率為97.5%～103.6%。

關鍵詞 溶菌酶； 發光金納米粒子； 熒光方法

1 引 言

溶菌酶是一種高等電點的酶\\， 廣泛存在于身體組織以及分泌物中。鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的體液及微生物中也含有此酶， 其中蛋清中含量最豐富。溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、無毒性等優點， 并具有溶解一些細菌的特性\\。從雞蛋清中提取的溶菌酶\\還可以替代一些化學合成藥物， 用于食品防腐\\。此外，研究表明， 尿液和血清中溶菌酶的增加會導致白血病\\，腎臟疾病\\和腦膜炎\\等。因此，溶菌酶已被廣泛應用于生物工程和醫療領域。目前，有關溶菌酶的分析方法主要有動態濁度法\\和溶板法\\。近年來， 高靈敏測定溶菌酶的熒光方法也有報道， 由于溶菌酶本身不具有熒光，一些外源探針，主要是CdSe2/CdS和CdSe以及CdHgTe等發光量子點\\被廣泛采用。

近年來，納米尺寸的貴金屬粒子由于其獨特的發光性能備受關注\\。與上述發光量子點相比，直徑小于5 nm的發光金納米粒子（Luminescent gold nanoparticles， GNPs） 具有制備簡單、生物相容性好等優點，尤其是低毒性探針可能更適合分析一些含生物酶的系統。目前，利用各種方法制備的GNPs已被用于溶液中Hg2＋\\和Ni2＋\\的測定， 以及細胞成像分析\\。本研究將GNPs應用于TX-100及其臨界膠束濃度的測定\\。

本研究參照文獻\\合成了牛血清蛋白（BSA）修飾的GNPs，并考察了它們與溶菌酶及其它常見蛋白質的相互作用。結果表明， 隨著溶菌酶加入濃度的增加，GNPs的熒光明顯增強，而其它低等電點的蛋白質對GNPs的熒光影響很小，據此建立測定溶菌酶的熒光方法，并用于雞蛋清樣品和含蛋白質合成樣品中溶菌酶含量的測定，結果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計、U-3010紫外-可見分光光度計 （日本 Hitachi公司）; JEOL-2010高分辨電鏡 （HRTEM， 日本電子株式會社）； TGL-16C型高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）; pH酸度計 （杭州東星儀器設備廠）; 85-1型磁力攪拌器 （江蘇金壇正基儀器有限公司）。牛血清白蛋白 （BSA，上海生物工程有限公司）; HAuCl4#8226;4H2O （Sigma-Aldrich公司）; 溶菌酶 （Lysozyme Chloride，上海邁瑞爾化學技術有限公司）。0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）； 其它試劑均為分析純。水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 GNPs的制備\\ 將0.125 mL 1% HAuCl4#8226;4H2O （m/V）稀釋至20 mL，加入 134 mg BSA，劇烈攪拌 2 h，加入30.6 mg NaBH4， 繼續反應 24 h，高速 （11000 r/min） 離心除去顆粒較大的粒子，保留淡黃色的溶液。

2.2.2 樣品處理與檢測 在一系列 10 mL具塞試管中分別加入0.4 mL GNPs溶液，0.5 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液，然后加入不同量的標準試劑溶液或樣品溶液，稀釋到5 mL，常溫下放置10 min后進行熒光測定。測定在室溫 （20 ℃）下進行，采用10 mm石英液池，激發波長為 320 nm，激發和發射狹縫寬度為10 nm，光電倍增管的負高壓為700 V。

實驗用雞蛋樣品購于蕪湖當地市場，將蛋清與蛋黃分開，用PBS緩沖液（pH 7.0）將蛋清稀釋10倍。取適量上述樣品至GNPs溶液中，反應10 min后進行熒光測定。

3 結果與討論

3.1 發光金納米粒子的表征

由GNPs的透射電鏡圖（圖1）可見，合成的GNPs約5.1 nm，較均一。每個發光金納米粒子約包含100個小的金納米粒子\\。 圖1 發光金納米粒子的透射電鏡圖

Fig．1 TEM image of luminescent gold nanoparticles （GNPs）



合成出的金納米粒子的熒光光譜見圖2。在320 nm紫外光激發時，在410 nm處有一半峰寬大約為70 nm的熒光發射峰，該峰的產生可能與金5d10帶和6（sp）1導帶之間的電子躍遷有關\\。圖2還表明，在290 nm處有個很尖銳的紫外吸收峰，與文獻\\一致。以硫酸奎寧為標準，測得此發光金納米粒子的熒光量子產率為0.053，證明制備的發光金納米粒子具有較高的熒光量子產率\\。

3.2 發光金納米與溶菌酶之間的作用

溶菌酶是高等電點的蛋白質，pI＝11.2，而GNPs表面的BSA等電點為4.7\\，在pH 7.0的中性溶液中，GNPs和溶菌酶之間應該存在較強的靜電作用。如圖3所示，隨著溶菌酶濃度的增加，GNPs的熒光強度逐漸增加。此現象可能是溶菌酶在GNPs表面因靜電作用形成了保護層，鈍化了GNPs的表面，從而使得GNPs的熒光逐漸增強。在向GNPs中加入其它一些低等電點的蛋白質時，GNPs的熒光基本不變；按照文獻\\合成的表面帶正電荷的發光金，在相同條件下也未與溶菌酶之間發生明顯的相互作用而出現增敏現象。

圖2 BSA修飾的發光金納米粒子的紫外可見吸收光譜（a）和熒光光譜（b）

Fig．2 UV-vis absorption spectra （a） and fluorescence spectra （b） of BSA-modified gold nanoparticles

圖3 GNPs在不同濃度溶菌酶存在下的熒光光譜圖

Fig．3 Fluorescence spectra of GNPs in the presence of different concentration of lysozyme

由1～8溶菌酶的濃度依次為（Concentrations of lysozyme 1－8）： 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.5，2.5，3.5，4.5，6.0，8.0

SymbolmA@ mol/L。

由圖4可見，隨著NaCl濃度的增加，體系的熒光強度逐漸降低，最終趨于穩定狀態。發光金納米粒子具有很好的穩定性\\，即使在高濃度鹽溶液中也不會因自身團聚而發生光譜改變。實驗表明，GNPs和溶菌酶之間的確存在較強的靜電相互作用。圖5給出了加入溶菌酶前后熒光衰減曲線。當向4.0×10－6 mol/L GNPs中加入8.0×10－6 mol/L溶菌酶時，熒光壽命從7.94

SymbolmA@ s增加到8.96

SymbolmA@ s，這進一步說明溶菌酶和GNPs之間的靜電作用可能使得GNPs表面鈍化，從而導致GNPs的熒光增強\\。

圖4 離子強度對體系熒光增敏的影響

Fig．4 Effect of NaCl on the fluorescence enhancement of GNPs at 0. 01 mol/L pH 7 .0 PBS buffer

Concentrations of lysozyme and GNPs were 3.0×10－6 and 4.0×10－6 mol/L， respectively.

圖5 熒光衰減曲線

Fig．5 Fluorescence decay curves

λex＝320 nm， λem＝410 nm.



3.3 實驗條件優化

3.3.1 發光金納米粒子濃度選擇 實驗表明，GNPs的熒光強度隨著其濃度的增加而增大。但GNPs濃度過大（＞5.0×10－5 mol/L，依據BSA濃度計算\\）時，會出現自猝滅現象\\，熒光強度反而降低?？刂戚^低的GNPs的濃度，能降低熒光本底，對提高測定靈敏度有利。但過低的GNPs濃度，會導致發光不穩定，也減小了測定溶菌酶的線性范圍。本實驗GNPs濃度選擇4.0×10－6 mol/L。

3.3.2 酸度與介質的影響 圖6給出在4.0×10－6 mol/L溶菌酶存在和不存在的條件下，pH值對發光金納米粒子熒光強度的影響。 圖6 在溶菌酶存在 （F） 和不存在 （F0）條件下，pH值對發光金粒子熒光強度的影響

Fig．6 Effect of pH on fluorescence intensity of GNPs in the presence （F） and absence （F0） of lysozyme

GNPs和溶菌酶濃度均為4.0×10－6 mol/L（Both the concentration of lysozyme and GNPs were 4.0×10－6 mol/L）。發光金粒子本身在不同pH值熒光強度呈現一定的波動，在pH＞11時強度較大，這與文獻\\一致，可能是不同pH值時發光金的表面態不同所致。最大的熒光增強出現在pH 7.0附近，在此酸度下，溶菌酶帶有較高的正電荷。而Zeta電勢實驗表明，此條件下發光金粒子表面帶有較高的負電荷（數據未列出），二者間強的靜電相互作用可能有效地導致了發光金表面鈍化，并增強其熒光發射。因此，本實驗選擇pH 7.0的PBS緩沖溶液控制反應的酸度。



3.3.3 反應時間的影響

考察了反應時間對溶菌酶測定的影響。結果表明，試劑混合后， 熒光逐漸增強； 反應10 min后，熒光強度達到最大，并在隨后的20 min內基本保持穩定。本實驗選擇反應10 min后進行熒光測定。

3.4 干擾實驗



混合體系中發光金的濃度4.0×10－6 mol/L，溶菌酶的濃度為6×10－7 mol/L，考察了可能共存的物質對測定的影響。結果表明，以相對熒光強度變化±5%計，共存組分允許存在的濃度見表1。1000倍的維生素C、維生素B、維生素E；800倍半胱氨酸、高半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖、多巴胺；500倍人血清蛋白、卵白蛋白、伴白蛋白、卵粘蛋白、血紅素、肌紅球素；一些重金屬離子，如Ni2＋， Cu2＋， Hg2＋， Ag＋，在10倍情況下對體系的熒光有一定的猝滅作用，而同等濃度的高等電點的細胞色素C對體系有明顯的增加作用。但它們在實際樣品中含量大多較低，一般不會對測定產生影響。

在最佳條件下，GNPs的熒光強度與溶菌酶的濃度在2×10－7～8×10－6 mol/L范圍內呈現良好線性關系。F－F0＝38.223＋151.07CLys（10－6 mol/L），線性相關系數R＝0.996，檢出限為3.0×10－8 mol/L。對4.0×10－6 mol/L溶菌酶平行測定6次，標準偏差為2.6%?？梢姳痉椒ň哂休^高的分析靈敏度和重現性。

3.6 合成樣品和實際樣品的測定

采用本法測定了實際蛋清樣品中溶菌酶的含量，結果見表2?；厥章蕿?7%～104%，溶菌酶含量在46～55 mol/L范圍，與文獻\\基本一致?？紤]到溶菌酶在其它一些實際應用體系中可能含有一定的蛋白質及其它共存物質，考察了3種合成樣品中溶菌酶的含量（表3），測定的相對誤差均小于

SymbolqB@ 5%，表明本方法適用于其它實際樣品中溶菌酶含量的測定。

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Fluorescence Enhancement Method for Determination of Lysozyme Using

Fluorescent Gold Nanoparticles as Probe



QIAN Zhang-Sheng， LIU Mei-Gui，TIAN Da-Hui， HAO Dan， ZHU Chang-Qing

（Anhui Key Laboratory of Chemo-Biosensing， College of Chemical and Materials Science， 

Anhui Normal University， Wuhu 241000）

Abstract As lysozyme has the property of dissolving some bacteria， it can be applied in medical treatment， biological engineering， and especially in food antisepsis to replace chemically synthesized ones. Therefore， the development of a simple analytical method for lysozyme assay is very important. Here， water-soluble BSA-modified fluorescent gold nanoparticles （GNPs） were prepared according to the literature， and their interaction with lysozyme was investigated. A novel fluorescence method for the determination of lysozyme has been developed based on the enhancement effect of lysozyme on the fluorescence of GNPs. The effects of GNPs concentration， pH， reaction time and coexisting substances on the determination were tested. Under the optimum conditions， i.e. 4.0 ×10－6 mol/L GNPs， pH 7.0， and reaction time of 10 min， the linear range of the calibration curve was from 2×10－7 mol/L to 8×10－6 mol/L and the detection limit was 3.0×10－8 mol /L. The relative standard deviation was 2.6% for six replicate measurements of a solution containing 4.0×10－6 mol/L lysozyme. The method bore the merits of high sensitivity， good water-solubility and low-toxicity of probe. Meanwhile， some common proteins with low isoelectric point almost did not interfere with the determination. The proposed method was applied to the determination of lysozyme in synthetic samples and chicken eggs white， the average recoveries were 97.5%－103.6% were obtained.

Keywords Lysozyme; Fluorescent gold nanoparticles; Fluorescent method

（Received 25 October 2010; accepted 13 February 2011）

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文