3種酶聯(lián)免疫分析法在蓖麻毒素定量測定中的比較

摘 要 建立了蓖麻毒素的3種酶聯(lián)免疫定量分析法，即光吸收、熒光和化學(xué)發(fā)光免疫分析法，并系統(tǒng)優(yōu)化了各項實驗條件。結(jié)果顯示: 對于化學(xué)發(fā)光檢測法，當(dāng)酶標(biāo)抗體HRP-4C13稀釋倍數(shù)為1∶8000時可獲得最佳的信噪比，且酶與底物反應(yīng)3 min后信號趨于穩(wěn)定。隨后在各自優(yōu)化的條件下將3種方法用于毒素的檢測。比較結(jié)果表明: 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法除具有線性范圍寬（0.02～5.5

@ g/L，r2＝0.999）、靈敏度高（檢出限為5 ng/L）的特點外，還具有簡單、快速、體系穩(wěn)定性好等優(yōu)點。將本方法用于不同實際樣品基質(zhì)，如飲用水、碳酸飲料、奶粉、咖啡和血清中添加的蓖麻毒素的檢測，其檢出限為0.005～0.08

@ g/L，回收率為89.6%～108.8%，適于污染及中毒樣品中痕量蓖麻毒素的定量分析。

關(guān)鍵詞 蓖麻毒素; 酶聯(lián)免疫分析; 化學(xué)發(fā)光

1 引 言

蓖麻毒素（Ricin）是從大戟科植物蓖麻籽（Ricinu communis）中分離出來的一種II型核糖體失活蛋白，其相對分子量約為66 kDa，由A鏈（約32 kDa）和B鏈（約34 kDa）通過二硫鍵聯(lián)接而成。其中A鏈為效應(yīng)鏈，具有失活核糖體的能力；B鏈含有兩個半乳糖殘基結(jié)合位點，能與細(xì)胞上含半乳糖殘基的糖蛋白或糖脂結(jié)合，從而介導(dǎo)毒素進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性。蓖麻毒素來源廣泛、毒性極高，成年人口服8粒蓖麻籽即足以致死；且其易于提取、性質(zhì)穩(wěn)定，是一種極有可能被用作恐怖襲擊或制造極端事件的生物毒素。為應(yīng)對蓖麻毒素潛在的恐怖威脅，亟需建立準(zhǔn)確、快速和靈敏的檢測技術(shù)和方法。

目前，根據(jù)蓖麻毒素所具有的理化特性和免疫原性已發(fā)展出多種檢測方法，其中多以免疫分析法為主。而免疫分析法中的酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）既具備抗原抗體反應(yīng)的特異性，又結(jié)合酶的高效催化性及信號放大體系等優(yōu)點，因此其已成為檢測蓖麻毒素的主要有效手段。但目前文獻(xiàn)中報道的方法普遍存在靈敏度低等限制而無法直接應(yīng)用于痕量生物醫(yī)學(xué)樣品的分析。本研究立足于不同檢測策略的角度，分別建立了3種酶聯(lián)免疫分析法，即光吸收、熒光和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）對蓖麻毒素進(jìn)行定量分析，并在線性范圍、檢出限（LOD）、精密度、特異性等方面進(jìn)行了比較研究，其中CLIA除具有操作簡單、分析時間短、無放射性污染等特點外，還具有靈敏度高、特異性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，其檢測靈敏度高達(dá)0.005

@ g/L，已成功應(yīng)用于飲料、食品和血清等實際樣品基質(zhì)中添加蓖麻毒素的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LS55型熒光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；SpectraMax M5/M5e型多功能酶聯(lián)免疫分析儀（美國Molecular Devices公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）。化學(xué)發(fā)光HRP底物試劑盒（美國Millipore公司）。

蓖麻籽（北京秀禾種子有限公司）；N，N，N′，N′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），對氨基苯基-1-巰基-β-D-半乳糖苷-瓊脂糖樹脂，G75型葡聚糖凝膠樹脂（美國Sigma公司）； Fast Flow型DEAE Sepharose（美國Amersham Biosciences公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京天佑達(dá)生物工程技術(shù)有限公司）； 對羥基苯丙酸（HPPA，美國Alfa Aesar）。抗蓖麻毒素單克隆抗體3D74和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗蓖麻毒素單克隆抗體4C13（HRP-4C13）由本單位王玉霞研究員惠贈；人血清（中國人民解放軍307醫(yī)院）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純； 飲用水、碳酸飲料、奶粉、咖啡均為市售商品。所有溶液均以Milli-Q超純水（美國Millipore A10 型純水儀）配制。

2.2 實驗方法

2.2.1 蓖麻毒素的提取 取50 g蓖麻籽，去殼，在200 mL PBS緩沖液中勻漿。勻漿液于4 ℃浸泡24 h后濾殘渣，上清液于4 ℃以12000 r/min離心30 min。棄去沉淀和上層油脂后，以85％飽和度的（NH4）2SO4沉淀上清液中的蛋白質(zhì)。冰浴中緩慢攪拌4 h，于4 ℃以12000 r/min離心15 min，棄上清液，將沉淀用適量10 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.4）溶解，即得蓖麻毒素粗提液。

將對氨基苯基-1-巰基-β-D-半乳糖苷-瓊脂糖樹脂裝柱，用PBS緩沖液平衡后，加入粗提液，于4 ℃下充分結(jié)合30 min。依次用PBS緩沖液、10 mmol/L D-半乳糖-PBS緩沖液洗滌除去雜蛋白，最后用150 mmol/L D-半乳糖-PBS緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。將G75型葡聚糖凝膠樹脂裝入層析柱中，經(jīng)10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.4） 清洗平衡后加入上述親和層析洗脫液，隨后用10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.4） 洗脫，收集280 nm處存在紫外吸收的洗脫組分。將收集液通過活化的Fast Flow型DEAE sepharose陰離子交換樹脂，以80 mmol/L Tris-NaCl緩沖液洗脫，即獲得高純度蓖麻毒素，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析毒素純度。

2.2.2 光吸收-酶聯(lián)免疫分析法測定蓖麻毒素 將抗蓖麻毒素單克隆抗體3D74用0.05 mol/L碳酸鹽包被緩沖液 （pH 9.6） 稀釋至1 mg/L，向酶標(biāo)板中每孔加入0.1 mL，于4 ℃下包被過夜。次日，棄去包被液，用PBS-T （10 mmol/L PBS＋0.1% Tween-20）洗滌3次，甩干。每孔加入0.3 mL封閉液（1% BSA），于37 ℃下孵育3 h，甩干。將配制在PBS稀釋緩沖液（PBS-BSA，10 mmol/L PBS＋ 0.5% BSA，pH 7.4）中的系列濃度為1.4， 2.8， 5.6， 7.7， 11.2和15.4

@ g/L的蓖麻毒素加入到酶標(biāo)板中，每孔0.1 mL，同時設(shè)置陰性對照孔，于37 ℃下孵育1 h后用PBS-T洗滌3次，甩干。加入1∶3000稀釋的HRP-4C13，每孔0.1 mL，37 ℃下孵育40 min后用PBS-T洗滌6次，甩干。每孔加入0.1 mL顯色底物TMB，室溫反應(yīng)7 min后， 以2 mol/L H2SO4終止該顯色反應(yīng)。于450 nm波長處測量吸光度值。

2.2.3 熒光-酶聯(lián)免疫分析法測定蓖麻毒素 包被、封閉、加樣等基本操作同2.2.2。本法中蓖麻毒素的系列濃度設(shè)置為0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2， 6.4和12.8

@ g/L。加入1∶1500稀釋的HRP-4C13并于37 ℃下孵育40 min， 用PBS-T洗滌6次，甩干。每孔加入0.1 mL 60 mmol/L對羥基苯丙酸溶液作為熒光底物，室溫反應(yīng)15 min后， 以50

@ L 0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，測定熒光強度。激發(fā)與發(fā)射波長分別為320和413 nm，狹縫寬度均為15 nm。

2.2.4 CLIA法測定蓖麻毒素 包被、封閉、加樣等操作同2.2.2節(jié)。蓖麻毒素的系列濃度設(shè)為0.005， 0.01， 0.02， 0.17， 0.34， 0.68， 1.38， 2.75和5.5

@ g/L。加入1∶8000稀釋的HRP-4C13并于37 ℃下孵育40 min，用PBS-T洗滌6次，甩干。加入化學(xué)發(fā)光底物，室溫反應(yīng)3 min后測量化學(xué)發(fā)光強度。

2.2.5 CLIA法檢測不同基質(zhì)中蓖麻毒素加標(biāo)樣品 分別取純凈水1 mL、某碳酸飲料1 mL、奶粉1 g、咖啡0.3 g和人血清1 mL，均加入9 mL PBS稀釋緩沖液、混勻，用上述基質(zhì)溶液將蓖麻毒素分別稀釋為不同濃度后以CLIA法進(jìn)行檢測。同時，分別用以上基質(zhì)溶液將蓖麻毒素配制成0.3， 0.6和2.5

@ g/L，混勻后于4 ℃下以12000 r/min離心20 min，測定上清液中蓖麻毒素含量，計算出每種基質(zhì)中蓖麻毒素的回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 蓖麻毒素的分離

蓖麻籽粗提液中主要成分為蓖麻毒素RCA 60、蓖麻凝集素RCA 120和大量的雜蛋白，由于RCA 60和RCA 120具有半乳糖殘基結(jié)合位點，可采用半乳糖苷偶聯(lián)的瓊脂糖樹脂對其進(jìn)行親和層析，經(jīng)10 mmol/L 半乳糖溶液洗去大部分雜蛋白后，用150 mmol/L半乳糖溶液將RCA 60和RCA 120同時洗脫。由于洗脫樣品中含有較高濃度的鹽，且pH值也不適于后續(xù)的離子交換層析，因此選用凝膠過濾層析將洗脫樣品脫鹽，并將緩沖體系pH值調(diào)至8.4。利用這兩種蛋白質(zhì)的等電點差異，采用陰離子交換層析對混合物進(jìn)行分離，分離效果見圖1。SDS-PAGE凝膠電泳圖見圖2。結(jié)果表明：含80 mmol/L NaCl的緩沖液可洗脫得到電泳純的蓖麻毒素，而更高的鹽濃度則可洗脫凝集素。

圖1 陰離子交換層析洗脫曲線

Fig．1 Elution curve of anion-exchange chromatography

圖2 純化蓖麻毒素SDS-PAGE分析圖

Fig．2 SDS-PAGE analysis of purified ricin and ricin agglutinin（RCA）

1． 未還原的蓖麻毒素； 2. 未還原的蓖麻毒素凝集素； 3. 經(jīng)二硫蘇糖醇還原的蓖麻毒素； 4. 經(jīng)二硫蘇糖醇還原的蓖麻毒素凝集素;5. 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker。1. RCA60 under nonreducing condition; RCA120 under nonreducing condition; 3. RCA60 treated with dithiothreitol（DTT）; 4. RCA120 treated with DTT; 5. Standard molecular weight proteins.

3.2 蓖麻毒素檢測條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)\\，優(yōu)化熒光-ELISA和CLIA中酶標(biāo)抗體HRP-4C13的最佳稀釋比例及與各自發(fā)光底物的最佳反應(yīng)時間。

在熒光-ELISA法中，當(dāng)包被抗體3D74濃度為1 mg/L，酶標(biāo)抗體HRP-4C13（2.5 g/L）稀釋比例在1∶10000～1∶1500范圍時，熒光強度呈上升趨勢；稀釋倍數(shù)為1∶1500～1∶1000時，熒光強度趨于飽和。兼顧檢測靈敏度及HRP酶標(biāo)抗體的用量，本研究選擇HRP-4C13的稀釋倍數(shù)為1∶1500。熒光-ELISA法中，熒光底物反應(yīng)時間在15 min內(nèi)，熒光強度上升較為明顯，隨后熒光強度趨于平緩，即選擇15 min時終止反應(yīng)測量熒光強度。

在CLIA法中，較高濃度的HRP-4C13會導(dǎo)致空白值增加，當(dāng)HRP-4C13稀釋倍數(shù)為1∶8000時，樣品的發(fā)光強度最強，且空白本底值較低，因此HRP-4C13稀釋倍數(shù)選擇為1:8000。最佳化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)時間同樣由對底物反應(yīng)時間的監(jiān)測曲線得到，3 min后發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，從而選擇3 min后測量化學(xué)發(fā)光強度。

3.3 3種酶聯(lián)免疫分析方法中的蓖麻毒素檢測

在優(yōu)化條件下，采用3種酶聯(lián)免疫分析法對蓖麻毒素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度的測定，方法結(jié)果見表1。由表1可見，CLIA法最為靈敏，其LOD比光吸收-ELISA和熒光-ELISA分別低3和2個數(shù)量級，同時其線性范圍較寬，可達(dá)2個數(shù)量級。據(jù)文獻(xiàn)\\報道，成年人經(jīng)肌肉注射或靜脈注射蓖麻毒素的半數(shù)致死劑量約為5～10

@ g/kg。而本研究建立的CLIA法的LOD可達(dá)到0.1% LD50，顯著低于蓖麻毒素半數(shù)致死劑量，為實現(xiàn)中毒人員體內(nèi)微量蓖麻毒素的檢測和體內(nèi)毒物代謝動力學(xué)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

3.4 3種酶聯(lián)免疫分析法的檢測特異性

將3種免疫分析方法用于檢測蓖麻毒素、蓖麻凝集素和相思子毒素，以驗證3種方法的特異性。以光吸收法為例，結(jié)果見圖3，吸光度隨蓖麻毒素濃度增加而增大；而檢測蓖麻凝集素和相思子毒素時，響應(yīng)值與空白對照接近。在同樣實驗條件下，熒光-ELISA法和CLIA法對3種樣品的檢測結(jié)果與光吸收法一致。這表明實驗中所用的單克隆抗體的特異性好，同時也說明所建立的方法準(zhǔn)確、可靠。 圖3 光吸收法特異性檢測曲線

Fig．3 Curves of specificity of optical absorption method

3.5 CLIA法檢測復(fù)雜基質(zhì)加標(biāo)樣品中的蓖麻毒素

3種免疫分析方法的比較結(jié)果表明，與另外兩種分析方法相比，CLIA具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性高、精密度好等特點，故選擇其用于復(fù)雜基質(zhì)中的蓖麻毒素加標(biāo)樣品的定量檢測。蓖麻毒素污染體系通常為飲用水、飲料和食品等，進(jìn)入人體后主要存在于血液和組織中。將蓖麻毒素配制在水、某碳酸飲料、奶粉、咖啡和血清樣品中，采用CLIA法測定這些基質(zhì)加標(biāo)樣品中毒素的檢出限、線性范圍及回收率，結(jié)果見表2。上述樣品中，蓖麻毒素在奶粉基質(zhì)中的檢出限顯著低于其它基質(zhì)，這歸因于奶粉中大量的酪蛋白和乳清蛋白對毒素和抗體活性的保護(hù)作用。

本研究采用了光吸收法、熒光法和化學(xué)發(fā)光法定量分析蓖麻毒素。實驗結(jié)果表明， 化學(xué)發(fā)光法（CLIA）由于不需要任何光源照射，避免了光源穩(wěn)定性、光散射等因素對分析檢測結(jié)果造成的影響，且其靈敏度比光度法、熒光法高2～3個數(shù)量級。 CLIA法將更適用于污染與中毒樣品中的微量蓖麻毒素的定量檢測。

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Comparison of Three Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Methods for

Quantitative Determination of Ricin

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MA Xiao-Xi， LIU He-Zhu， TANG Ji-Jun， GUO Lei， XIE Jian-Wei

（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， Beijing 100850）

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Abstract Three determination methods in enzyme-linked immunosorbent assay， namely optical absorption， fluorescent and chemiluminescent immunoassay， were established for quantitation of biotoxins protein ricin in various matrices. The detection conditions were systematically optimized. The results showed the best signal-to-noise （SNR） could be obtained for CLIA when dilution factor was 1∶8000; and the chemiluminescence signal was stable at around 3 minutes after horseradish peroxidase reacted with its substrate. Whereafter， the three methods were compared for determination of ricin under individually optimized conditions. The comparative results indicated that chemiluminescent immunoassay could provide wider linear range （from 0.02

@ g/L to 5.5

@ g/L with correlation coefficient of 0.999）， higher sensitivity （limit of detection was 0.005

@ g/L）， and could be adopted as a simple， rapid and robust approach. The CLIA method was applied to measure the spiked ricin in water， carbonated beverage， milk powder， coffee and human serum samples. The limits of detection and the recoveries were from 0.005 to 0.08

@ g/L and from 89.6% to 108.8%， respectively. The method was quite suitable for quantitative determination of trace amounts of ricin in contaminated or poisoned samples.

Keywords Ricin; Enzyme-linked immunosorbent assay; Chemiluminescent immunoassay

（Received 20 August 2010; accepted 28 October 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文