毛細(xì)管電泳前沿分析法及分子模擬輔助研究牛血清白蛋白與熒光素鈉的相互作用

摘 要 應(yīng)用毛細(xì)管電泳前沿分析法研究了熒光素鈉與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用，利用游離熒光素鈉平臺峰高度和熒光素鈉濃度與峰高的線性關(guān)系得出游離以及與BSA結(jié)合的熒光素鈉濃度，將不同濃度比的熒光素鈉-BSA相互作用體系進(jìn)行電泳，考察結(jié)合情況，進(jìn)一步采用非線性方程和線性方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，得到了熒光素鈉和蛋白質(zhì)在286和294 K下的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)；通過考察熱力學(xué)參數(shù)推斷二者之間主要以疏水作用力結(jié)合;借助計算機軟件對二者之間的相互作用進(jìn)行了模擬分析。

關(guān)鍵詞 熒光素鈉； 牛血清白蛋白； 毛細(xì)管電泳前沿分析； 相互作用

1 引 言

熒光素及其衍生物不僅常作為生物大分子指示劑及生物細(xì)胞染色劑，同時在衛(wèi)生保健領(lǐng)域也得到應(yīng)用，如在作為診斷試劑方面，熒光素鈉注射液是眼底血管熒光造影首選造影劑，也用于手術(shù)中顯示膽囊和膽管，以及結(jié)核性腦膜炎的輔助診斷。熒光素類衍生物還可作防腐藥和輕瀉劑。此外，國外已有熒光素用于診斷癌癥的報導(dǎo)，且其本身具有一定抗癌作用。血清白蛋白在血漿中各種內(nèi)源性和外源性化合物存儲與轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。目前對熒光素生物結(jié)合反應(yīng)的作用機理和平衡規(guī)律尚在研究中，尤其近來發(fā)現(xiàn)注射熒光素鈉注射液會有不良反應(yīng)，因此研究熒光素鈉與血清白蛋白的相互作用對理解藥物作用機理，提高藥效和開發(fā)新藥具有一定的意義。熒光素的化學(xué)名為9-（2'-羧基苯基）-6-羥基-3H-咕噸-3-酮，熒光素鈉的結(jié)構(gòu)見圖1。

毛細(xì)管電泳方法是目前獲得大分子和小分子相互作用的重要方法之一，具有高效、快速、模式多變、耗樣量少，對樣品純度要求不高及更接近體內(nèi)的結(jié)合行為等優(yōu)點。當(dāng)前，偶氮類、噻嗪類和吖啶類等染料被廣泛應(yīng)用于臨床和醫(yī)藥領(lǐng)域，但是利用毛細(xì)管電泳方法研究蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的報道并不多。文獻(xiàn)\\采用熒光光譜考察熒光素鈉和BSA的相互作用，但該實驗是在pH 2.2 的條件下進(jìn)行的。本研究利用毛細(xì)管電泳前沿分析技術(shù)，在接近生理條件下研究熒光素鈉和牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用，對熒光素鈉和BSA之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)目以及熱力學(xué)作用類型進(jìn)行考察，并借助計算機模擬探討二者之間的結(jié)合方式，為掌握藥物和人血清白蛋白的結(jié)合機制提供線索。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HP3DCE型高效毛細(xì)管電泳儀（Agilent Technologies公司），DAD檢測器； 0.01 mol/L Tris-HCl電泳緩沖液（pH 8.0）；未涂漬熔融石英毛細(xì)管柱（40 cm×50

@ m I.D.，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）。電泳采用壓力進(jìn)樣：5.0 kPa， 40 s; 分離電壓15 kV。熒光素鈉和BSA購自北京拜爾迪生物公司。

2.2 實驗方法

配制熒光素鈉與BSA（10

@ mol/L）不同濃度比的混合溶液，混勻，過夜孵育后進(jìn)行電泳，由游離熒光素鈉的濃度與其平臺峰高度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（10～220

@ mol/L）計算游離藥物濃度，進(jìn)而得到與BSA結(jié)合的藥物濃度（表1），再分別采用非線性回歸及線性方程擬和實驗數(shù)據(jù)，計算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 進(jìn)樣時間的優(yōu)化

考察不同進(jìn)樣時間（10～50 s）對平臺峰形成的影響。實驗表明，在熒光素鈉（400

@ mol/L）和BSA（8

@ mol/L）混合樣品中，游離熒光素鈉的峰高隨進(jìn)樣時間的延長而逐漸增加，同時峰形變寬，逐漸形成平臺峰。當(dāng)進(jìn)樣時間為30 s時，平臺峰高基本不再增大（圖1）；40 s時得到的熒光素鈉平臺峰峰高重現(xiàn)性良好，并且平臺峰峰高和濃度呈良好的線性關(guān)系。本研究最終選擇40 s作為實際電泳實驗的進(jìn)樣時間。

 圖1 熒光素納的結(jié)構(gòu)和進(jìn)樣時間對平臺峰的影響?yīng)?/p>

Fig．1 Stracture of fluorecein effect of injection time on plateau peak height

圖2 熒光素鈉（FS）和BSA（100

@ mol/L）混合平衡溶液樣品在490 nm波長下電泳譜圖

Fig．2 Electrophoretogram of fluorescein sodium（FS）-BSA mixture solution at wavelength of 490 nm

FS concentration(

@ mol/L): a. 50; b. 80; c.120; d.160; e. 200.

3.2 286和294 K溫度下熒光素鈉與BSA相互作用結(jié)合參數(shù)的測定

分別在286和294 K溫度下，固定BSA的濃度為100

@ mol/L，改變熒光素鈉濃度（50～200

@ mol/L），進(jìn)行熒光素鈉-BSA混合平衡溶液樣品的毛細(xì)管電泳。由于在490 nm波長下只能檢測到熒光素鈉，所以混合樣品中游離熒光素鈉所形成的平臺峰更清晰。在實驗濃度范圍內(nèi)，固定BSA的濃度，隨著體系中熒光素鈉的濃度增加，未與BSA結(jié)合的游離熒光素鈉濃度也不斷升高（圖2）。

分 析 化 學(xué)第39卷

第5期姜 萍等: 毛細(xì)管電泳前沿分析法及分子模擬輔助研究牛血清白蛋白與熒光素鈉的相互作用

熒光素鈉濃度在10～220

@ mol/L范圍內(nèi)，熒光素鈉平臺峰高與濃度呈良好線性關(guān)系，H＝0.8731＋02011Cf（R＝0.9995）。據(jù)此線性方程，可計算游離熒光素鈉的濃度，進(jìn)而計算結(jié)合比（r），具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 在286和294 K下，不同濃度熒光素鈉與100

@ mol/L BSA混合平衡溶液的毛細(xì)管電泳前沿分析測定數(shù)據(jù)

Table 1 Data for fluorescein sodium-BSA equilibrium solutions determined bycapillary electrophoresis/frontal analysis at 286 and 294 K

3.2.1 非線性擬合當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和藥物的結(jié)合位點相互獨立時，它們的平衡關(guān)系可以用多級平衡方程式表示：

r＝b＝∑mi＝1nikif1＋kif（1）

其中，r為每摩爾蛋白質(zhì)所結(jié)合的藥物摩爾數(shù)，即結(jié)合比; \\b為與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物濃度， \\f為游離藥物濃度; \\為蛋白質(zhì)濃度; m為蛋白質(zhì)分子中與藥物結(jié)合的結(jié)合位點的總類數(shù); ki為蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合常數(shù); ni為蛋白分子中第i類與藥物結(jié)合的位點數(shù)。分別以286和294 K下的r對\\f作圖，用非線性擬合。結(jié)果表明，熒光素鈉與BSA的結(jié)合符合單Langmuir 吸附等溫線，BSA分子中有一類與熒光素鈉的強結(jié)合位點，即

r＝nk1＋kf（2）

如圖3所示，在286 K時，結(jié)合位點數(shù)n＝2.37，結(jié)合常數(shù)K＝1.42×104 L/mol；在294 K時，結(jié)合位點數(shù)n＝2.35，結(jié)合常數(shù)K＝1.57×104 L/mol。 

圖3 在286 K（a）和294 K（b）時，熒光素鈉與BSA相互作用的非線性回歸曲線

Fig．3 Non-linear regression curve for the interaction between fluorescein sodium and BSA at

286 K（a） and 294 K（b）

實驗表明，熒光素鈉并不是非特異性地結(jié)合在蛋白質(zhì)的表面。熒光素鈉與BSA 之間存在一類強結(jié)合位點，對比286和294 K兩個溫度可見，隨著溫度升高，結(jié)合常數(shù)略有增大，推測可能是溫度升高分子之間的熱運動促進(jìn)了二者之間的結(jié)合。同時，隨著溫度升高，雖然擬合計算結(jié)果中結(jié)合位點種類以及結(jié)合位點的數(shù)目并沒有顯著增加，但是觀察擬合曲線發(fā)現(xiàn)，294 K非線性擬合的誤差大于286 K，這可能是由于升高溫度會加劇小分子擴散，小分子與蛋白的結(jié)合已經(jīng)在一定程度上偏離單Langmuir 吸附等溫線；尤其在高濃度情況下，藥物小分子還會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的二級構(gòu)象發(fā)生較大變化。上述分析有待進(jìn)一步考察驗證。 圖4 在286 K和294 K時， 熒光素鈉與BSA相互作用的Klotz線性回歸曲線

Fig．4 Klotz linear regression curve for interaction between fluorescein sodium and BSA at 286 K and 294 K



3.2.2 線性擬合 當(dāng)藥物和蛋白的結(jié)合位點總類數(shù)m＝1時，多級平衡方程可以簡化為不同形式的線性方程式，如Klotz方程，其中r為結(jié)合比；Cf是未結(jié)合（游離）藥物的濃度; n為結(jié)合位點數(shù)；K為結(jié)合常數(shù)。

1R＝１n＋1nkCf（3）



對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Klotz方程線性擬合（圖4）得到，286 K 下熒光素鈉與BSA的n＝2.42， K＝1.33×104L/mol; 在294 K下，n＝2.37， K＝1.58×104 L /mol。結(jié)果表明，非線性和線性擬合兩種方法得到的結(jié)果基本一致。

3.3 熱力學(xué)參數(shù)的求解及討論

小分子與生物大分子之間的非共價相互作用包括氫鍵、范德華力、靜電力和疏水作用力。結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)是確認(rèn)相互作用力模式的重要依據(jù)。本研究利用在286和294 K下的結(jié)合常數(shù)，根據(jù)Van′t Hoff方程求得此溫度范圍內(nèi)該相互作用體系的熵變（ΔS）和Gibbs自由能變（ΔG）。

從表2可見，ΔH＞0，ΔS＞0，利用Ross等總結(jié)的規(guī)律分析，熒光素鈉與BSA之間主要是以疏水作用力結(jié)合。ΔG＜0 說明結(jié)合過程為自發(fā)的放熱反應(yīng)。對于藥物和蛋白相互作用體系，ΔS＞0通常被作為存在疏水相互作用的依據(jù)，但ΔS＞0也被認(rèn)為存在靜電作用。結(jié)合白蛋白的分子結(jié)構(gòu)分析，在毛細(xì)管電泳前沿分析所考察的濃度范圍內(nèi)，熒光素鈉和BSA存在一類強結(jié)合位點，推測具有剛性芳環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光素鈉可能是通過插入BSA的強疏水性口袋以疏水作用與BSA相結(jié)合。另外，熒光素鈉分子表面還有羧基、羰基等基團，所以不排除與BSA之間還存在有氫鍵以及靜電作用等。

3.4 分子模擬研究

利用分子對接軟件對白蛋白與熒光素鈉之間的結(jié)合情況進(jìn)行了模擬，鑒于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中尚無BSA的結(jié)構(gòu)信息，基于BSA和人血清白蛋白（HSA）的高序列同源性（76.52%），且不同氨基酸均為保守性替換，以RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫HSA與R-法華令配合物的晶體結(jié)構(gòu)（編碼2BXD）為模板，使用ACD/ChemSketch11.0軟件對熒光素鈉結(jié)構(gòu)進(jìn)行作圖和三維結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，利用iGEMDOCK軟件進(jìn)行HSA與熒光素分子對接， 圖5 人血清白蛋白與熒光素鈉相互作用的分子對接圖

Fig．5 Picture of molecular docking between HSA and fluorescein Sodium對接結(jié)果如圖5所示。熒光素鈉與HSA的結(jié)合位置主要位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA，熒光素鈉的3個共平面的環(huán)結(jié)構(gòu)插入到HSA的疏水口袋。此外，分子對接的能量計算表明，二者之間存在氫鍵以及靜電作用和范德華力。蛋白質(zhì)的Arg-222，257和Ser-287殘基與熒光素鈉中的羥基，以及蛋白質(zhì)His-242的氨基與熒光素鈉中的羰基之間都可以形成氫鍵。熒光素與堿性氨基酸殘基Arg-222可以發(fā)生靜電作用。通過對同源蛋白人血清白蛋白與熒光素鈉分子模擬對接，進(jìn)一步證明熒光素鈉是通過插入BSA的強疏水性口袋以疏水作用與BSA相結(jié)合，同時BSA與熒光素鈉之間還有氫鍵、靜電作用和范德華力。

3.5 小結(jié)

本研究利用毛細(xì)管電泳前沿分析法研究表明BSA與熒光素鈉相互作用有一類的強結(jié)合位點，非線性回歸求得286 K和294 K下熒光素鈉與BSA的結(jié)合位點數(shù)及結(jié)合常數(shù)分別為n＝2.37， K＝1.42×104 L/mol; n＝2.35， K＝1.57×104 L/mol。利用一定溫度范圍內(nèi)熱力學(xué)參數(shù)ΔG， ΔH 和ΔG，并結(jié)合分子模擬對接，在該類結(jié)合位點上熒光素鈉與BSA之間主要是疏水作用，另外還有氫鍵、靜電作用和范德華力。研究表明，在接近人體pH值的條件下，兩者作用力主要以疏水作用為主。另外，Barbero等應(yīng)用穩(wěn)態(tài)熒光光譜考察了pH 7.5條件下，白蛋白（1

@ mol/L）與熒光素鈉（0.1～2

@ mol/L）的結(jié)合常數(shù)在1.45×106～50.0×106 L/mol范圍內(nèi)，與本研究所測定的結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級不同，分析是考察研究對象所使用的方法及樣品濃度范圍與本研究不同所致。



References

1 JIANG Guo-Zhi， LIU Wen-Zhong， TANG Li-Mei， CHEN Qing-Yun， SONG Xian-Bin（江國志，劉文忠，唐麗梅，陳青云，宋憲斌）. I(xiàn)nner Mongolia Petrochemical Industry（內(nèi)蒙古石油化工）， 2002， 27: 15～16

2 Kosa T， Maruyama T， Otagiri M.Pharm. Res.， 1997， 14（11）: 1607～1612

3 Cajlakovic M， Bizzarri A， Ribitsch V.Anal. Chim. Acta， 2006，573/574: 57～64

4 Cheng Z， Levi J， Xiong Z，Gheysens O， Keren S， Chen X， Gambhir S S. Bioconjugate Chem.， 2006， 17（3）: 662～669

5 Kamat B P， Seetharamappa J. Polish. J. Chem.， 2004， 78（5）: 723～732

6 HUANG Xun， SUN Ai-Min， DING Xue-Qin， XU Xiu-Cheng， FANG Lu-Yan（黃 勛，孫愛民，丁雪琴，許秀成，方魯延）. Journal of Biomedical Engineering（生物醫(yī)學(xué)工程雜志）， 2006， 23（6）: 1325～1327

7 Barbero N， Barni E， Barolo C.Dyes and Pigments， 2009， 80（3）: 307～313

8 LI Lin-Wei，WANG Dong-Dong， SUN De-Zhi， WEI Xin-Ting， LIU Min， ZHAO Qiang（李林尉，王冬冬，孫德志，魏新庭，劉 敏，趙強）. Chem. J. Chinese Universities（高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報）， 2008， 29（6）: 1211～1215

9 Feldman H A. Anal. Biochem.， 1972， 48: 317～341

10 Ross P D， Subramanian S. Biochemistry， 1981， 20 （11）: 3096～3102

11 Maruyama T， Lin C C， Yamasaki K， Miyoshi T， Imai T， Yamasaki M， Otagiri M. Biochem. Pharm.， 1993， 45（5）: 1017～1026

12 Rosenoer V M， Oratz M， Rothschild M A. Albumin Structure， Fuction and Uses， Oxford: Pergamon Press， 1977: 27

Study of Interaction of Fluorescein Sodium and Bovine Serum

Albumin by Capillary Electrophoresis/Frontal Analysis and

Molecular Modeling Technology



JIANG Ping1， WU Li-Qing2， RENA Baktur1， LI Qin1，

HU Xiao-Ming1， DAI Rong-Ji1， GENG Li-Na1， DENG Yu-Lin1

1（School of Life Science， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

2（National Institute of Metrology， Beijing 100013）

Abstract The interaction between fluorescein sodium and bovine serum albumin was investigated by capillary electrophoresis/frontal analysis. Free drugs′ concentrations of fluorescein sodium in different systems of fluorescein sodium blended with BSA by different concentration ratio were known through standard curve of drug concentration and plateau peak height. The experimental data were fitted respectively by a Klotz linear and non-linear regression curve fitting program. The binding constant， the numbers of binding sites and thermodynamic parameters were obtained in the temperatures of 286 K and 294 K. The hydrophobic force was determined by thermodynamic parameters. Finally， computer software was also used to simulate the interaction.

Keywords Fluorescein sodium; Bovine serum albumin; Capillary electrophoresis/frontal analysis; Interaction

（Received 17 July 2010; accepted 6 November 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文