N-(6-嘌呤)-蛋氨酸探針測定生物樣品中蛋白質(zhì)含量

摘 要 以 NaCl 為介質(zhì)，在Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）中，三維熒光光譜顯示核苷類藥物N-（6-嘌呤）-蛋氨酸（PYMBA）與人血清白蛋白可以發(fā)生相互作用。結(jié)果表明，PYMBA 的加入使得人血清白蛋白內(nèi)源熒光猝滅，且體系的同步熒光強度和溶液中人血清白蛋白的濃度呈良好的線性關(guān)系，基于此，建立了測定蛋白質(zhì)的新方法。在選定的最佳實驗條件（Δλ＝50 nm，離子強度為 0.1 mol/L，pH＝7.4）下，同步熒光強度與人血清白蛋白在 2.8～552 mg/L 范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為 0.9985。運用本方法測定人血清、唾液和尿液等生物樣品中的蛋白質(zhì)含量并進行加標回收實驗，回收率在 98.0%～103.1% 之間。本方法的檢出限可達 0.1 mg/L。本方法所得結(jié)果與經(jīng)典的考馬斯亮藍法一致。

關(guān)鍵詞 N-（6-嘌呤）-蛋氨酸（PYMBA）； 人血清白蛋白（HSA）； 同步熒光光譜； 三維熒光

1 引 言

蛋白質(zhì)是人體中一類重要的生物大分子。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，是多種內(nèi)源和外源性化合物在體內(nèi)運輸和貯存的載體和靶分子。作為存儲和轉(zhuǎn)運蛋白，血清白蛋白的分析一直是臨床檢驗中診斷疾病和檢查療效的重要指標，是所有蛋白質(zhì)中研究最廣泛的一種，因此血清白蛋白的分析和測定對于臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品等行業(yè)具有重要意義。目前，測定血清白蛋白的方法有凱氏定氮法、分光光度法、熒光光度法、共振光散射法和電化學(xué)方法等。同步熒光光譜法與常規(guī)熒光分析法相比具有窄化譜帶、簡化光譜、減小光譜重疊及可減小散射光影響等優(yōu)點。文獻\\采用同步熒光技術(shù)分析了環(huán)境樣品中的多環(huán)芳烴化合物 （PAHs），Hu等基于亞甲基藍和DNA的相互作用， 應(yīng)用同步熒光法進行DNA含量的測定。同時該項技術(shù)也成功應(yīng)用于多組分的同時測定，因此同步熒光法具有一定的應(yīng)用前景。 圖1 N-（6-嘌呤）-蛋氨酸的結(jié)構(gòu)式 

Fig．1 Structure of 2-（9H-purin-6-ylamino）-4-（methylthio） butanoic acid （PYMBA）本研究基于 HSA 和 PYMBA 的相互作用，以 PYMBA 為熒光探針，運用同步熒光方法測定蛋白質(zhì)含量。 

蛋氨酸又稱甲硫氨酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位之一，是人體必需的8種氨基酸中唯一含硫的氨基酸。蛋氨酸通過參與機體的氧化還原反應(yīng)，實現(xiàn)其抗氧化、抗毒作用。它參與體內(nèi)甲基的轉(zhuǎn)移和磷的代謝以及腎上腺素、膽堿和肌酸的合成，是合成蛋白質(zhì)和谷胱甘肽的原料，在抗衰老和疾病防治方面有廣闊的應(yīng)用前景，N-（6-嘌呤）-蛋氨酸（2-（9H-purin-6-ylamino）-4-（methylthio） butanoic acid， PYMBA）是一類新型核苷類藥物中間體（圖1），本實驗以 PYMBA 為熒光探針，測定生物樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FP-6500 熒光分光光度計（日本分光公司）； BS-110S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）； PB-10 型酸度計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

4.0×10－5 mol/L人血清白蛋白（華蘭生物工程股份有限公司）溶液，1.0×10－3 mol/L PYMBA溶液。所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。Tris-HCl緩沖液用于調(diào)節(jié)體系的 pH 值，0.5 mol/L NaCl 用于調(diào)節(jié)體系的離子強度。

2.2 實驗方法 

將2.0 mLTris-HCl 緩沖液（pH 7.4），2.0 mL 0.5 mol/L NaCl，0.2 mL PYMBA及適量 HSA 標準溶液，依次加入到10 mL容量瓶中，以二次去離子水定容，搖勻。熒光分光光度計的發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為 5 nm，Δλ＝50 nm，用 1 cm 石英吸收池，以同步熒光信號對激發(fā)波長測繪同步熒光光譜圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 同步熒光光譜

按上述實驗條件進行同步熒光光譜掃描，得到了 PYMBA-HSA 體系的同步熒光光譜（圖2）。由圖2可見，在最佳實驗條件下，同步熒光強度隨著人血清 圖2 PYMBA-HSA 體系同步熒光光譜圖

Fig．2 Synchronous fluorescence spectra of PYMBA with HSA under the optimum conditions

CPYMBA＝2.0×10－5 mol/L; CHSA from 1～18 （

@ mol/L）＝0， 0.4， 0.8， 1.2， 1.6， 2.0， 2.4， 2.8， 3.2， 3.6， 4.0， 4.4， 4.8， 5.2， 5.6， 6.0， 6.4， 6.8 .白蛋白濃度的增加而有規(guī)律的增大，呈良好的線性關(guān)系。

3.2 三維熒光光譜

血清白蛋白分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等殘基而能夠發(fā)射較強的內(nèi)源熒光。按實驗方法得到 HSA 和 HSA-PYMBA 體系的三維熒光光譜圖（圖3）。由圖3可見，λex＝λem（Δλ＝0），是瑞利散射線；峰1是色氨酸和酪氨酸的殘基熒光峰，因為在激發(fā)波長為 280 nm 時HSA中的這兩個殘基有很強的熒光。從峰強度變化程度可見：峰 1 與峰 2 的熒光強度分別為103.1 和 27.4。加入 PYMBA 后，兩峰的熒光強度分別減小到 81.2和 25.8。顯然， PYMBA 對兩個峰都有猝滅效果。這表明 PYMBA 分子與 HSA 的結(jié)合部位可能位于氨基酸所處的疏水腔中，PYMBA 分子的引入導(dǎo)致了這種疏水微環(huán)境極性的改變，進而導(dǎo)致了HSA 構(gòu)象的變化。

圖3 HSA （a）， HSA-PYMBA （b）體系的三維熒光光譜圖

Fig．3 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA （a） and HSA-PYMBA system （b）

1.6×10－6 mol/L HSA; 2.0×10－5 mol/L PYMBA．

3.3 最佳反應(yīng)條件的選擇

3.3.1 Δλ 的選擇 Δλ 值對本方法的靈敏度與選擇性有直接影響。在一定條件下， 考察了Δλ取不同值時體系的同步熒光光譜特征。當 Δλ＝50 nm 時，可以得到同步熒光信號最強且半寬度最小的單峰同步熒光光譜（圖4）。本實驗選擇 Δλ＝50 nm。 圖4 不同的Δλ 值對熒光強度的影響?yīng)?/p>

Fig．4 Fluorescence intensity of HSA-PYMBA system with different Δλ value 

1.6×10－6 mol/L HSA; 2.0×10－5 mol/L PYMBA．

3.3.2 pH值的影響 考察了pH值在7.0～9.0 范圍內(nèi)，對PYMBA-HSA 體系同步熒光強度的影響（圖5a）。結(jié)果表明，pH＝7.4 時，體系的穩(wěn)定性較好、靈敏度較高。選定pH值為7.4，固定其它試劑的用量，分別取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL 的 Tris-HCl 緩沖溶液，測定體系的同步熒光值，結(jié)果見圖5b。從圖5b可見，當Tris-HCl 緩沖溶液用量為2.0 mL時， 同步熒光值最大。

3.3.3 離子強度的影響 實驗使用0.5 mol/L NaCl溶液考察了離子強度對體系同步熒光強度的影響。結(jié)果表明：NaCl用量在1.0～4.5 mL范圍時，離子強度對體系的同步熒光強度有影響；當NaCl用量為2.0 mL，即離子強度為01 mol/L時，體系靈敏度最高。因此，本實驗選擇離子強度為01 mol/L，即2.0 mL 0.5 mol/L NaCl溶液作為離子強度緩沖液。圖5 pH值及緩沖溶液用量對體系熒光強度的影響?yīng)?/p>

Fig．5 Effect of different pH value and dosage of buffer solution on fluorescence intensity

1.6×10－6 mol/L HSA; 2.0×10－5 mol/L PYMBA.

3.3.4 加入順序的影響 考察了多種加入順序?qū)w系同步熒光強度的影響。當加入順序為 Tris-HCl→NaCl→PYMBA→HSA時，體系的同步熒光強度最高、且穩(wěn)定性最好。

3.3.5 PYMBA 用量的影響 考察了不同濃度的 PYMBA 對體系的同步熒光強度的影響。結(jié)果表明，PYMBA 的濃度越高，體系的熒光強度越低，導(dǎo)致靈敏度下降。而加入低濃度的 PYMBA 雖然有較高的靈敏度，但重現(xiàn)性變差。綜合考慮，PYMBA 的濃度選定為2×10－5 mol/L。

3.4 共存物質(zhì)的影響?yīng)?/p>

考察了一些常見離子和有機物存在時，對蛋白質(zhì)測定的影響。相對誤差控制在±5% 內(nèi)，以下物質(zhì)共存（倍）不干擾測定：K＋ （72）， Ca2＋ （36）， NH＋4 （65）， SO2－4 （9）， PO3－4 （21）， Mg2＋（14）， Na＋（11）， Cl－（77）， 淀粉 （27）， 葡萄糖 （108）， 麥芽糖 （22）， 檸檬酸 （6）， L-鼠李糖 （8）。

3.5 蛋白質(zhì)的測定

在最佳實驗條件下，以體系的同步熒光強度對 HSA 濃度繪制標準工作曲線，體系的同步熒光強度與 HSA 在2.8～552.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為I＝12.2＋185.2×107CHSA， 相關(guān)系數(shù)為R＝0.9985。對11份 PYMBA 空白溶液進行平行測定，以3倍標準偏差計算得檢出限為 0.1 mg/L。

血清樣品由河南師范大學(xué)校醫(yī)院提供，唾液和尿樣均采自人體，樣品經(jīng)稀釋一定倍數(shù)后按照上述實驗方法進行測定，并做加標回收實驗，測定結(jié)果見表1，與經(jīng)典的考馬斯亮藍法作對照，兩者測定結(jié)果一致。實驗表明，本方法簡便、快速、穩(wěn)定、可靠，適用于現(xiàn)代生物科學(xué)研究、臨床診斷、質(zhì)量檢驗等工作中大批量樣品的快速測定。

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Determination of Protein in Biological Samples by Probe of

2-（9H-Purin-6-ylamino）-4-（methylthio） Butanoic Acid

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CUI Feng-Ling， XING Wei-Wei， JIANG Xiao-Ying， ZHANG Xiao-Li， CHENG Shan， HUO Rui-Na

（School of Chemistry and Environmental Science， Henan Normal University， Xinxiang 453007）

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Abstract In Tris-HCl and NaCl medium， the three-dimensional fluorescence spectra of HSA-2-（9H-purin-6-ylamino）-4-（methylthio）（PYMBA） system showed that the PYMBA can react with serum albumin and the endogenous fluorescence of human serum albumin was quenched. At the same time， the fluorescence intensity of the system was proportional to the concentration of serum albumin. Based on this， a synchronous fluoresc ence method for the determination of trace proteins was developed. The fluorescence intensity of the system was in direct proportion to the concentration of protein in the range from 2.8 to 552.0 mg/L， with the detection limit of 0.1 mg/L for HSA when Δλ＝50 nm， Tris-HCl buffer （pH 7.4） and ionic strength was 0.1 mol/L of NaCl solution. This method was applied to determine the proteins in human serum， urine and saliva samples and the recovery was 98.0%－103.1%. The results obtained with this method coincided with those obtained by the coomassie brilliant blue method. The effects of coexistent substances were also investigated. 

Keywords 2-（9H-purin-6-ylamino）-4-（methylthio）; Human serum albumin; Synchronous fluorescence spectra; Three-dimensional spectra

（Received 6 June 2010; accepted 29 November 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文