基于毛細管液滴技術的血液乙型肝炎病毒DNA提取

摘 要 基于毛細管液滴技術，建立了提取血液中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的方法。方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛細管中連續引入油相和水相溶液時，由于表面張力作用， 可以形成穩定的油包水型液滴。依次引入含有不同試樣的液滴，在毛細管中完成進樣、DNA結合、洗滌以及洗脫等過程。實驗表明，采用蛋白酶K裂解和提高洗脫溫度有利于提高DNA回收率。優化后的血清HBV DNA提取操作在25 min內完成，回收率大于60%。本方法的DNA提取量與常規方法相當，而相對標準偏差較大（23.3% vs 12.9%）。本方法具有簡單、快速和低成本的優勢，有望成為一種微全核酸分析系統樣品前處理的有效解決方案。

關鍵詞 微全核酸分析系統; DNA提取; 液滴; 毛細管; 乙型肝炎病毒

1 引 言

微全分析系統是將分析實驗室的全部功能集成于一個微型化裝置，應用于包括分子診斷、細胞分析等領域。用于核酸分析的微全系統主要包括DNA純化、擴增與檢測等功能單元。已報道的多種基于微流控芯片平臺的微全核酸分析系統，顯示出了微型化、集成化、低消耗以及分析快速的優勢。芯片微全核酸分析系統也面臨一些問題，如加工和使用成本高、控制復雜等。針對這一問題，許多研究者致力于開發低成本微型化核酸分析裝置。以標準毛細管為反應器的振蕩流PCR裝置，為實現低成本微全核酸分析帶來了希望。上述裝置使用壓力差或微量注射泵驅動PCR液滴在不同溫度區間往復運動，實現熱循環反應。這種設計減少了溫度變化延遲，因而可以顯著縮短反應時間。由于使用標準毛細管作為反應器，振蕩流PCR裝置具有明顯的成本優勢。這種核酸分析方法面臨的問題是未能集成核酸提取與純化，因而尚不能實現集成化核酸分析。針對該問題，本研究基于毛細管液滴技術，建立了DNA提取方法，并用于提取血液中乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）DNA。本方法利用聚四氟乙烯（PTFE）的疏水特性，在毛細管中形成油包水液滴。通過向毛細管中依次引入含有不同試樣的液滴完成DNA提取及純化。本方法有望與振蕩流PCR結合，發展成為低成本微全核酸分析系統。

2 實驗部分

2.1 實驗裝置 

自行搭建的分析裝置(圖1a)有兩個溫度控制模塊，每個模塊從上至下分別為聚碳酸酯蓋板、帶有毛細管嵌合溝槽的加熱鋁板、Peltier加熱片（北京帕爾貼公司）以及固定鋁板。加熱鋁板表面有8個平行溝槽，嵌有聚四氟乙烯毛細管（內徑1.0 mm，外徑1.4 mm，江蘇宏泰公司）。毛細管末端與多通道微量注射泵（保定蘭格公司）連接，通過設定注射泵運行程序控制管中液滴的運動。在溫控模塊上方的聚碳酸酯蓋板上有溝槽，用于插入磁鐵。加熱鋁板鑲嵌有PT 100溫度傳感器（東陽三星公司），與溫控器 (日本Yamatake公司)連接，用于探測溫度。計算機控制軟件根據溫度感應反饋信號至溫控器，控制下位繼電器是否輸送電流至Peltier加熱片。控制軟件界面顯示已經運行和尚未進行的注射泵運行程序，以及各個溫度模塊的設定與實際溫度。

圖1 (a)毛細管核酸提取裝置結構示意圖，(b)DNA提取過程示意圖

Fig．1 (a) Schematic representation of experimental instrument， (b) Illustration of process of droplet-based DNA extraction in a capillary

1. 加熱模塊（Heating modules）; 2. PT 100溫度傳感器（Sensor); 3. 磁鐵(Magnet)；4. 微量注射泵(Syringe pump);

5. 繼電器(Relay); 6. 電源(Electric power source); 7. 溫控器(Distributed multi-channel controller); 8. 計算機(Computer)。

2.2 DNA提取與純化

毛細管中DNA提取使用磁珠提取試劑盒（杭州博日公司）。HBV陽性與陰性樣品（小牛血清，美國Invitrogen公司）經熒光定量PCR分析確認。含HBV血液加入血清管，靜置后獲得血清。使用加熱裂解提取法時，微量注射泵控制毛細管順序吸取5

@ L礦物油，25

@ L 裂解液，2

@ L磁珠液和5

@ L血清。微量注射泵拖動上述溶液在90℃溫區停留1 min后運行至30℃溫區，并在該溫區往復運動，完成磁珠與DNA結合。之后，液滴運行至磁鐵區，將磁珠定位于該區。排出廢液后引入10

@ L洗滌液，洗滌磁珠兩次，最后引入10

@ L洗脫液洗脫DNA。使用蛋白酶K裂解法時，首先將10

@ L血清，10

@ L蛋白酶緩沖液與1

@ L蛋白酶K加入試管，混合后在室溫下放置15 min。微量注射泵控制毛細管順序吸入5

@ L礦物油、4

@ L結合液、2

@ L磁珠液以及10

@ L血清裂解液。隨后，在毛細管中依次完成結合、洗滌和洗脫。毛細管每次使用后依次用5 mol/L HCl和純凈水各清洗1 min，再用礦物油潤洗帶走管壁殘留水滴。使用常規方法的對照實驗在微量離心管中進行，先在Mycycler PCR儀（德國Bio-Rad公司) 上進行加熱裂解，之后在磁力架上完成洗滌及洗脫。

對毛細管液滴方法與常規方法提取血清HBV DNA的回收率進行比較。測試樣品為用小牛血清稀釋獲得的一系列不同濃度標準HBV DNA溶液。使用兩種方法提取的DNA均使用紫外分光光度計測定OD260/280比值，并使用HBV定量PCR試劑盒（上海科華公司）在熒光定量PCR儀(LightCycler 480，瑞士Roche公司)進行定量分析，獲得HBV DNA拷貝數。DNA回收率＝洗脫液DNA拷貝數/原液DNA拷貝數×100%。提取HBV DNA的PCR產物同時在自制激光誘導熒光檢測芯片電泳分析儀上分析， 分析條件參見文獻\\。

3 結果與討論

3.1 毛細管中的液滴形成與運輸

微液滴技術被廣泛用于樣品混合、運輸和反應，具有體積小、效率高和反應條件穩定的優勢。油包水液滴的形成需要在疏水表面實現，此時水相與油相間的表面張力小于水相與管壁間的表面張力。PTFE毛細管高度疏水特性為液滴形成和液滴反應提供了理想的條件。依次引入油相與水相溶液時，由于表面張力作用形成油包水型液滴。液滴的形成可以保持樣品濃度的穩定，消除樣品分子擴散和水份蒸發。為考察毛細管中液滴的穩定性，在室溫條件下控制含有1 g/L FITC-BSA (北京博奧森公司) 的液滴在毛細管中連續往返運行。40個循環后液滴仍然保持完整。熒光顯微鏡(IX71， 日本Olympus公司)下檢測未見管壁有熒光物質殘留，說明由于液滴形成水相溶液與通道壁不存在直接接觸。

3.2 毛細管液滴法DNA提取

文獻\\報道了微流控平臺上結合液滴和磁珠技術的DNA提取并顯示出簡便、快速的優勢。這類方法的局限在于需要對微流控裝置進行疏水涂層，此外分析通量有限。相比之下，PTFE毛細管不僅可以為液滴操作提供理想的疏水表面，也易于實現平行化操作。毛細管液滴法提取DNA的原理是：順序向毛細管中引入含有磁珠、樣品、洗滌液和洗脫液的液滴，在液滴中完成樣品-試劑混合、DNA結合、磁珠洗滌以及DNA洗脫（圖1b）。在此過程中，油包水型液滴起到微閥功能，避免了因表面吸附可能造成的交叉污染；運動中液滴內部的主動混合效應可以加速DNA結合、洗滌和洗脫，起到微混合器作用；磁珠在外部磁場驅動下進入含有不同試樣的液滴，為DNA結合提供固相界面。

3.2.1 裂解方式對DNA提取的影響 考察了加熱裂解法和蛋白酶K裂解法。加熱裂解法是在加熱和使用表面活性劑及變性劑條件下，促使膜蛋白及DNA結合蛋白變性沉淀并釋放出DNA。蛋白酶K裂解法則是在蛋白酶作用下，使蛋白質片段化，從而游離DNA。使用常規離心管時，加熱裂解法和蛋白酶K裂解法均能高效回收DNA，相比之下蛋白酶K裂解法的回收率更高一些（圖2a）。然而，在毛細管中使用高溫裂解法時DNA的回收率較低，其拷貝數僅約為對照實驗1/4（圖2a）。對此結果的解釋是，液滴在高溫下不穩定，引起樣品在毛細管表面吸附因而造成回收率降低。為證實這個假設，向毛細管中引入含有 1 g/L FITC-BSA的液滴，驅動其90℃條件下于毛細管中往復運動1 min，再將毛細管在熒光顯微鏡下拍照。結果顯示，毛細管表面可見熒光物質吸附。此結果提示液滴在高溫下不穩定，樣品組份突破包裹油層接觸并滯留在管壁，因而影響了DNA回收率。相比之下，使用蛋白酶K裂解法時所有操作在較低溫度下進行，所以不存在明顯表面吸附效應。當采用蛋白酶K裂解時，毛細管液滴DNA提取法的回收率得到顯著改善，但與在試管中的平行操作所得結果相比， 毛細管液滴DNA提取法的回收率仍然偏低（圖2a)，考慮是油-水界面對樣品的捕獲影響了DNA的結合效率。

3.2.2 結合與洗脫條件對DNA提取的影響 考察了結合時間以及洗脫時間、洗脫溫度對DNA提取效率的影響。由圖2b可見，液滴中的DNA與磁珠可以在2 min內達到最大結合量。相比之下，低濃度樣品結合效率較高。2 min 結合時間條件下103拷貝/

@ L HBV DNA的回收率超過90%，而105拷貝/

@ L HBV DNA樣品的回收率只能達到50%。相比傳統磁珠DNA提取方法，毛細管液滴方法所需結合時間顯著縮短（2 min vs 10 min）。這可能是

圖2 DNA提取條件優化 

Fig2 Optimization of experimental conditions for DNA extraction

a. 加熱裂解和蛋白酶K裂解方法處理同一個HBV陽性血清樣品所得DNA的結果，加熱裂解條件為90℃，

1 min，蛋白酶K裂解條件為室溫下15 min； b. 不同結合時間對HBV DNA的回收率的影響，樣品經蛋白酶K裂解，DNA結合、洗滌和洗脫時間分別為 1， 2和2 min；c.不同洗脫條件下的DNA回收效率。樣品經蛋白酶K裂解，DNA結合和洗滌時間分別為 1和2 min。a. Quantitations of hepatitis B virus (HBV) DNA extracted from serum samples that experienced high temperature lysis and proteinase lysis; b. Recoveries of HBV DNA with different binding time， the samples were lysed with proteinase K; c. Recoveries of HBV DNA under different elution conditions.由于微體系中分子擴散距離的縮短及液滴主動混合效應加速了DNA與磁珠的結合。

圖2c顯示不同洗脫條件下的HBV DNA回收率。在較低溫度（30℃）下，延長洗脫時間可以提高DNA回收率。提高溫度可以縮短洗脫時間，50℃ 時洗脫1 min即可接近最大洗脫量。但當洗脫溫度提高至60 ℃時，DNA回收率又有所下降。這可能是因為溫度升高使液滴變得不穩定，樣品的表面吸附引起DNA回收量減少。在結合2 min和50 ℃ 洗脫1 min的條件下，所考察不同濃度HBV DNA樣品的回收率均大于60%（圖2c）。

3.2.3 毛細管液滴DNA提取方法考察 優化后的血清HBV DNA提取過程：在室溫下，蛋白酶K裂解15 min，結合2 min，洗滌2 min兩次，在50 ℃下洗脫1 min，整個操作在25 min內完成。使用上述操作條件處理含有103、105和107 copy/

@ L水平的HBV血清樣品，并將結果與常規方法比較（表1）。兩種方法提取的所有DNA樣品OD260/280比值均大于1.8，提示兩種方法均有效純化了DNA。熒光定量分析結果顯示，毛細管液滴方法的DNA提取量與對照方法基本相當，但相對標準偏差大于對照方法（23.3% vs 12.9%）。本實驗獲得的DNA提取效率與微流控核酸提取方法相當，而進樣量偏差和樣品在油-水界面的捕獲可能是影響重現性的因素。

考察了毛細管液滴DNA提取方法的交叉污染可能性。連續3次交替處理了一個HBV拷貝數為107 copy/

@ L的陽性樣品和一個HBV陰性血清樣品，回收樣品加入PCR體系擴增40個循環。電泳分析表明，由HBV DNA陰性血清獲得的洗脫液PCR擴增結果均為陰性。說明使用此清洗方法可以有效去除毛細管表面樣品殘留，因此毛細管液滴DNA提取方法可用于連續樣品處理。

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Droplet-based Blood Hepatitis B Virus DNA Extraction in a Capillary

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LIANG Guang-Tie， WANG Qiu-Ping， WANG Wei， LIU Da-Yu， ZHOU Xiao-Mian

(Laboratory of Clinical Chemical Technology， Guangzhou First Municipal People's Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College， Guangzhou 510180)

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Abstract A novel in-capillary droplet-based DNA extraction method was developed， using the principle of water-in-oil droplet formation in the highly hydrophobic polytetrafluoroethylene capillary. By sequentially introducing droplets containing sample or reagents， all the steps related to blood hepatitis B virus (HBV) DNA extraction， including sample injection， DNA binding， magnetic beads rinsing and DNA elution were continuously implemented in the capillary. Experimental results showed that proteinase K lysis and elevated elution temperature facilitated higher extraction efficiency. With optimized conditions， an extraction was completed in 25 min with microliter level sample/reagent consumption. The droplet-based method achieved an extraction efficiency of ～60% that is comparable to that of a commercial method. However， the RSD of extraction efficiency was relatively higher. In summary， the droplet-based DNA extraction developed is simple， fast and low-cost. It has the potential to be integrated into a micro-total nucleic acid analysis system.

Keywords Micro-total nucleic acid analysis system; Deoxyribonucleic acid extraction; Droplet; Capillary; Hepatitis B virus

(Received 13 October 2010; accepted 23 December 2010)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文

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