磺酸化磁珠富集魚塘水中的孔雀石綠

摘 要 采用1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺及N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化磁珠表面羧基，將對氨基苯磺酸偶聯(lián)在磁珠表面，獲得磺酸化磁珠。以此磺酸化磁珠為吸附劑，建立了分散固相萃取富集魚塘水中孔雀石綠的新方法， 并對水體樣本的最佳吸附pH值及解吸附條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明： 當(dāng)水體樣本pH值在3.0～6.0之間，磺酸化磁珠對水體中孔雀石綠有較好的吸附，在pH＝4.0時(shí)，孔雀石綠的吸附效率達(dá)到最高，為82.4%±5.5%；乙腈可有效洗脫吸附在磺酸化磁珠表面的孔雀石綠。在25 ℃，pH 4.0 時(shí)，磺酸化磁珠吸附孔雀石綠的等溫吸附符合Langmuir模型。磁珠的最大吸附容量為66.7

@ g/g，Langmuir吸附平衡常數(shù)為0.375 L/

@ g。

關(guān)鍵詞 磁珠；孔雀石綠；分散固相萃取；魚塘水

1 引 言

孔雀石綠（Malachite green，MG） 屬堿性三苯甲烷類染料，由于抗菌、抗寄生蟲效力較強(qiáng)且價(jià)格便宜，被廣泛用于池塘水的水體消毒和防治魚類的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病。MG易被魚體吸收并迅速代謝為脂溶性的隱色孔雀石綠（LMG），具有致癌、致畸、致突變等副作用。許多國家都禁止將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。因此，嚴(yán)格監(jiān)控魚塘水孔雀石綠殘留量對于建立無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖， 保證食用者健康具有重要意義。

目前，含MG樣品的前處理一般采用液-液萃取法，然后通過強(qiáng)陽離子型固相萃取柱富集、凈化。整個過程繁瑣、耗時(shí)， 有機(jī)溶劑使用量大。分散固相萃取方法是近年來發(fā)展較快的樣本前處理技術(shù)，具有快速、簡便、廉價(jià)、高效、穩(wěn)定、安全且可直接用于渾濁樣本的前處理等優(yōu)點(diǎn)。然而，分散固相萃取采用的吸附劑粒徑均為幾十微米，材料比表面積較小，且不能在溶液中懸浮。納米級超順磁性材料因其良好的磁響應(yīng)性以及溶液分散性，在分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)以及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來，有關(guān)表面功能化磁珠在食品安全樣本前處理方面的報(bào)道逐漸增多。

本研究將納米至亞微米級磺酸化磁珠應(yīng)用于水樣中孔雀石綠的富集，有效地簡化了孔雀石綠樣本前處理步驟，縮短了前處理時(shí)間。建立了針對含痕量孔雀石綠魚塘水樣品的分散固相萃取前處理方法。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器與試劑

Waters 2489高效液色譜儀（Waters公司）；磁架（無錫中德伯爾公司）；FS-1200超聲波處理器（上海生析超聲儀器有限公司）；PSA NANO2590 Zeta電位分析儀（英國馬爾文公司）；JEM-1200EX透射電鏡（日本電子公司）；FTIR Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀（美國熱電尼高力公司）；離心機(jī)（Sigma公司）；純水儀（Milipore公司）。

孔雀石綠（MG）， 1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）、FeCl3#8226;6H2O、FeCl2#8226;4H2O（分析純，Sigma公司）；苯乙烯、丙烯酸、對氨基苯磺酸（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。池塘水，取自當(dāng)?shù)佤~塘。

2.2 磁珠的制備方法

2.2.1 羧基化磁珠的合成 參照文獻(xiàn)\\方法，采用化學(xué)共沉淀法合成超順磁性Fe3O4納米顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌后用氮?dú)獯蹈伞Ｓ帽揭蚁?環(huán)己烷（10∶1，V/V）混合液懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 min，將有機(jī)相轉(zhuǎn)入SDS和NaHCO3溶液懸浮，繼續(xù)超聲15 min，乳化形成微乳液。加K2S2O8，于70 ℃反應(yīng)30 min后加入丙烯酸，繼續(xù)反應(yīng)10 h。磁架吸附磁珠，95%乙醇洗滌磁珠表面至溶液無泡沫產(chǎn)生。

分 析 化 學(xué)第39卷

第5期張建文等：磺酸化磁珠富集魚塘水中的孔雀石綠

2.2.2 磺酸化磁珠的合成及預(yù)處理

取500 mg羧基化磁珠（表面羧基密度為2.5 mmol/g），分散于15 mL 0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 5.0）中，按磁珠表面羧基密度與EDC、Sulfo-NHS摩爾比為1∶2∶2分別加入47.9 mg EDC以及54.3 mg Sulfo-NHS，混合液室溫振蕩反應(yīng)0.5 h。磁架回收磁珠，以10 mL 0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 5.0）洗滌磁珠兩次。將10倍于磁珠表面羧基密度的對氨基苯磺酸溶液加入活化磁珠體系，溶液調(diào)至pH 8.0，室溫下振蕩反應(yīng)2 h。磁架回收磁珠，制備好的磺酸化磁珠采用飽和食鹽水浸泡1 h、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗滌各2 h，最后以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌磁珠至pH值為中性，并將磁珠重懸于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩＊?/p>

2.3 磺酸化磁珠富集水體中MG的檢測流程

取10 mL魚塘水，加入適量磺酸化磁珠，振蕩混勻，避光靜置吸附10 min，磁架分離磁珠，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）洗滌磁珠一次，200

@ L洗脫溶劑洗脫磁珠吸附的MG，洗脫液經(jīng)0.45

@ m濾膜過濾后直接用高效液相色譜法檢測。流動相為50 mmol/L 乙酸銨-乙腈緩沖液（4∶6，V/V，pH 4.5），洗脫液流速為1.0 mL/min； Sunfire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 mm），柱溫25 ℃；二極管陣列紫外檢測器，檢測波長618 nm；樣品進(jìn)樣量20 mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 磺酸化磁珠的表征

采用微乳法合成的磁珠經(jīng)透射電鏡分析（圖1），粒徑分布大致范圍為70～150 nm，大部分磁珠粒徑為100～120 nm。 圖1 磁珠電鏡圖

Fig．1 TEM image of magnetic beads采用EDC/Sulfo-NHS法將對氨基苯磺酸基修飾至羧基化磁珠表面，獲得的磺酸化磁珠用傅立葉紅外光譜儀掃描分析。其紅外圖譜與羧基化磁珠相比，在1174 cm－1處出現(xiàn)了一個新峰，該峰由磺酸基團(tuán)中SO鍵的對稱伸縮振動產(chǎn)生，說明磁珠表面存在磺酸基團(tuán)。測得磺酸基修飾以及羧基修飾磁珠的Zeta電位分別為－28.182和－21.932 mV，存在一定的差異。磺酸基與羧基相比，具有更低的pKa值。磺酸化增加了磁珠表面的Zeta電位，有利于磁珠在水相中的分散，同時(shí)增強(qiáng)了磁珠對溶液中陽離子物質(zhì)（如孔雀石綠）的吸附，且使富集過程不易受溶液pH值以及其它離子的干擾。

3.2 磺酸化磁珠富集水體中MG的條件優(yōu)化

3.2.1 pH值對磁珠富集水體中MG的影響 溶液中MG的電離度及磁珠表面的Zeta電位是影響磁珠靜電吸附MG的重要因素。因此，溶液的pH值是影響磁珠富集水體中MG的主要因素。取經(jīng)LC-MS確證不含MG的魚塘水10 mL，分別加入MG至終濃度為0.5

@ g/L。用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)魚塘水分別至pH 3， 4， 5和6，再分別加入5 mg磁珠富集溶液中的MG，用高效液相色譜法測定MG的富集量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。從表1可見，在pH 3～6之間，磺酸化磁珠對水體中MG均有較好的吸附效率（均大于69.3%）；在pH＝4.0時(shí)，吸附效率達(dá)到最高82.4%±5.5%。MG的pKa＝6.90，在pH 4.0時(shí)，MG完全離子化，帶正電荷；磺酸基的pKa＝0.70，在pH 4.0時(shí)，磺酸基的酸式解離幾乎不受影

3.2.2 不同洗脫液對回收率的影響 在不含MG的魚塘水中添加MG至終濃度為0.5

@ g/L，調(diào)節(jié)pH至4.0。用5 mg磺酸化磁珠富集10 mL上述魚塘水中的MG。磁架分離磁珠后，分別用不同體積比的甲醇-氨水混合液（90∶10，80∶20，70∶30，V/V）及純乙腈4種洗脫溶劑洗脫磁珠上的MG，洗脫溶劑用量為200

@ L。用不同洗脫

溶劑洗脫時(shí)的MG回收率見表2。從表2可見，4種洗脫溶劑對回收率的影響差異不大，為了便于液相色譜分析，本研究選擇純乙腈作為洗脫溶劑。

3.3 磺酸化磁珠吸附模式及飽和吸附容量的研究

在25 ℃， pH 4.0的條件下，取2 mg磺酸化磁珠富集10 mL水體中MG，其中MG濃度為5～50

@ g/L。依據(jù)MG濃度及磺酸化磁珠吸附量繪制吸附等溫線（見圖2）。通過擬合等溫吸附方程分析磺酸化磁珠對MG的吸附機(jī)制，并推算磁珠的飽和吸附容量。

 圖2 磁珠吸附魚塘水中MG的吸附等溫線

Fig．2 Adsorption isotherm of MG on magnetic beads

其吸附行為可用Langmuir吸附方程描述：

Ce/q＝1/（Kqm）＋Ce/qm

其中，q為吸附達(dá)平衡時(shí)單位質(zhì)量磁珠對MG的吸附量（

@ g/g），Ce為吸附達(dá)平衡時(shí)MG的濃度（

@ g/L），qm為單位質(zhì)量磁珠對MG的最大吸附容量（

@ g/g），K為Langmuir吸附平衡常數(shù)（L/

@ g）。以Ce為橫坐標(biāo)，Ce/q為縱坐標(biāo)作圖，可得到一條直線。擬合得的線性方程為Y＝0.015X＋0.04，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9978。說明磁珠對MG的模式為單分子層吸附。根據(jù)等溫吸附方程推算，磁珠對MG的飽和吸附容量為66.67

@ g/g，K＝0.375 L/

@ g。

3.4 水體中MG濃度對磺酸化磁珠吸附回收率的影響?yīng)?/p>

在25 ℃，pH 4.0的條件下，用5 mg磺酸化磁珠富集10 mL魚塘水中MG，其中MG濃度為0.05～10

@ g/L，用高效液相色譜法測定MG的富集量，計(jì)算回收率。不同MG濃度時(shí)的回收率見表3。結(jié)果顯示，水體中MG濃度在0～10

@ g/L之間吸附回收率無顯著性差異，均大于80％。

3.5 磁珠的重復(fù)使用性

磁珠的重復(fù)使用性在其實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義。本研究考察了磺酸化磁珠重復(fù)使用5次的平均回收率。

在25 ℃，pH 4.0的條件下，用5 mg磺酸化磁珠，富集10 mL MG濃度為1

@ g/L的魚塘水中的MG。使用后的磁珠按2.2.2節(jié)進(jìn)行活化預(yù)處理并重復(fù)使用5次，分別計(jì)算5次的MG回收率。結(jié)果表明，經(jīng)過5次使用后，回收率未見明顯下降，均大于80%。

3.6 魚塘水實(shí)際樣品的測定

針對不同疾病，池塘中MG使用濃度為0.002～0.5 mg/L。取南昌市周邊48份魚塘水實(shí)際樣品，按3.2節(jié)優(yōu)化后的方法富集其中的MG，采用高效液相色譜法檢測MG含量。其中只有1份水樣檢出含孔雀石綠，含量為0.12

@ g/L，說明本方法可用于實(shí)際魚塘水樣品中MG的檢測。



References

1 Yuan J， Liao L， Xiao X， He B，Gao S. Food Chem.， 2009， 113（4）: 1377～1383

2 Pourreza N， Elhami S. Anal. Chim. Acta，2007，596（1）: 62～65

3 Safarik I， Safarikova M. Water Res.，2002，36（1）: 196～200

4 Arroyo D， Ortiz M C， Sarabia L A， Palacios F. J. Chromatogr A，2008，1187（1-2）: 1～10

5 Anastassiades M， Lehotay S J， Stajnbaher D， Schenck F. J. Aoac. Int.， 2003， 86（2）： 412～431

6 Pankhurst Q A， Thanh N K T， Jones S K， Dobson J. J. Phys. D: Appl. Phys.， 2009， 42（22）: 224001～224015

7 Tiwari D K， Behari J， Sen P. World Applied Sciences Journal， 2008， 3（3）: 417～433

8 Hu C， Jia L， Liu Q， Zhang S. J. Sep. Sci.， 2010， 33（14）: 2145～2152

9 Rodriguez J A， Espinosa J， Aguilar-Arteaga K， Ibarra I S， Miranda J M. Microchim Acta， DOI 10.1007/s00604-010-0428-8

10 Yan F， Li J， Zhang J， Liu F， Yang W. J. Nanopart. Res.， 2009， 11（2）: 289～296

11 LU Shen-Zhou， LI Ming-Zhong， WANG Zhi-Qing（盧神州， 李明忠， 王志青）. Polymer Materials Science and Engineering（高分子材料科學(xué)與工程）， 2005， 21（2）: 296～299

12 Goldacre R J， Philips J N. Chem. Soc.， 1949， 1724～1732

13 Dean J A. Translated by SHANG Jiu-Fang， CAO Shi-Jie， XIN Wu-Ming， ZHENG Fei-Yong， LU Xiao-Ming， LIN Chang-Qing（尚久方， 操時(shí)杰， 辛無名， 鄭飛勇， 陸曉明， 林長青）. Lange′s Handbook of Chemistry（蘭氏化學(xué)手冊）. Beijing（北京）: Science Press（科學(xué)出版社）， 1991: 5～43

14 ZHAI Yu-Xiu， ZHANG Cui， NING Jin-Song，GENG Xia（翟毓秀， 張 翠， 寧勁松， 耿 霞）. Marine Fisheries Research（海洋水產(chǎn)研究）， 2007， 28（1）: 663～667



Enrichment of Malachite Green in Fishpond Water by

Sulfo-Functionalized Magnetic Beads

ZHANG Jian-Wen1， XIONG Yong-Hua1， CHEN Xue-Lan2， LI Xue3， LIN Xiao-Li1，

LI Huai-Ming1， GUO Liang1

1（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047）；

2（College of Life Science， Jiangxi Normal University; Nanchang 330022）

3（Wuxi Zodolabs Biotech Co.Ltd， Wuxi 214174）



Abstract Sulfo-functionalized magnetic beads were prepared by covalently conjugating aminobenzenesulfonic acid onto carboxyl surface of magnetic beads with 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbo-diimide（EDC）/N-hydroxysulfo succinimide（Sulfo-NHS） method. Those beads were used as dispersive solid phase extraction sorbent， and hence， a high efficient extraction procedure was developed for enriching trace amounts of malachite green （MG） in fishpond water. Parameters of adsorption and desorption of MG including pH value of fishpond water and elution solution were optimized. Results showed that sulfo-functionalized magnetic beads exhibited the high efficiency on enrichment of MG in fishpond water at pH 3.0－6.0 and the highest efficiency achieved at pH 4.0（82.4%±5.5%， n＝3）. Acetonitrile was effective in eluting MG on the magnetic beads. At pH 4.0 and 25 ℃， the adsorption behavior followed Langmuir adsorption isotherm with a maximum adsorption capacity of 66.67

@ g/g and a Langmuir adsorption equilibrium constant of 0.375 L/

@ g.

Keywords Magnetic beads; Malachite green; Dispersive solid phase extraction; Fishpond water

（Received 13 August 2010; accepted 15 December 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文