羥基自由基引起的脫氧核糖核酸損傷研究

摘 要 以鯡魚精脫氧核糖核酸（Herring sperm DNA）為研究對(duì)象，利用紫外光（UV， 200～275 nm， 66.4 Lx）激發(fā)納米TiO2發(fā)生光催化作用介導(dǎo)產(chǎn)生羥基自由基（Hydroxyl radical， #8226;OH），探討#8226;OH引發(fā)DNA氧化損傷特性。采用凝膠電泳和高效液相色譜（HPLC）分析法跟蹤DNA損傷歷程；應(yīng)用電子自旋共振（Electron spin resonance， ESR）及分光光度法跟蹤損傷過(guò)程氧化物種及H2O2相對(duì)濃度的變化；運(yùn)用生物標(biāo)準(zhǔn)樣8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine， 8-OHdG）為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)HPLC分析DNA損傷產(chǎn)物，研究DNA損傷機(jī)理。結(jié)果表明，較單純UV輻照或暗光（Dark）催化條件，DNA濃度10 mg/L，TiO2濃度1.5 g/L、pH 7～8，紫外光激發(fā)納米TiO2介導(dǎo)產(chǎn)生#8226;OH引發(fā)DNA損傷程度最大；DNA損傷為#8226;OH氧化歷程，并伴隨有深度氧化過(guò)程；DNA結(jié)構(gòu)中鳥(niǎo)嘌呤最易氧化損傷，8-OHdG為DNA氧化損傷中間產(chǎn)物及鳥(niǎo)嘌呤氧化損傷的特異產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞 脫氧核糖核酸損傷； 羥基自由基； 光催化； 8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷

1 引 言

脫氧核糖核酸（DNA）是所有生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，能調(diào)控生物的發(fā)育和生命機(jī)能的運(yùn)作。環(huán)境中多種因素如輻射、溫度、重金屬誘導(dǎo)DNA損傷。生物體中自由基參與許多重要的生命過(guò)程，自由基過(guò)多會(huì)使有機(jī)體發(fā)生損傷，主要表現(xiàn)在#8226;OH導(dǎo)致DNA的堿基和脫氧核糖發(fā)生化學(xué)變化，引起堿基改變、破壞或脫落及脫氧核糖分解等。目前對(duì)自由基導(dǎo)致DNA損傷的研究主要從延伸輻射產(chǎn)生介導(dǎo)自由基、自由基的種類引發(fā)DNA損傷及DNA損傷過(guò)程其結(jié)構(gòu)變化幾個(gè)方面展開(kāi)探討，而從光照激發(fā)光催化作用介導(dǎo)產(chǎn)生#8226;OH導(dǎo)致DNA損傷機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以鯡魚精DNA（Herring sperm DNA）為研究對(duì)象，利用紫外光（UV， 200～275 nm， 66.4 Lx）激發(fā)TiO2發(fā)生光催化反應(yīng)介導(dǎo)產(chǎn)生#8226;OH，研究#8226;OH與DNA相互作用機(jī)理，重點(diǎn)通過(guò)凝膠電泳和HPLC檢測(cè)DNA損傷程度，采用電子自旋共振（Electron spin resonance， ESR）及分光光度法跟蹤損傷過(guò)程氧化物種及H2O2相對(duì)濃度的變化，同時(shí)以生物標(biāo)準(zhǔn)樣8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine， 8-OHdG）為內(nèi)標(biāo)物，探究#8226;OH攻擊DNA結(jié)構(gòu)損傷位點(diǎn)，進(jìn)一步明確#8226;OH引起DNA氧化損傷機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

600E-SOLVENT高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）； ESP300E波譜儀（德國(guó)Brucker公司）；GE-100凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）。

10.0 mg/L鯡魚精DNA水溶液；10.0 mg/L 8-OHdG溶液；0.4 mol/L 5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5，5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide， DMPO）溶液；1.0 g/L辣根過(guò)氧化物酶（Peroxidase horseradish， POD）溶液；10.0 g/L N，N-二乙基對(duì)苯二胺（N，N-Diethyl-p-phenylenediamine， DPD）溶液；甲醇為色譜級(jí)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

在圓柱型硬質(zhì)石英瓶中加入10 mg/L鯡魚精DNA及1.0 g/L TiO2，放置暗處攪拌4 h，使DNA在催化劑表面吸附平衡，計(jì)時(shí)引入紫外光，間時(shí)取樣分析，以Dark/TiO2和單純UV為對(duì)照。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，調(diào)節(jié)不同底物pH及TiO2濃度，分析光催化損傷DNA的影響因素。電泳分析：1%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠，電壓101 V，電流80 mA，電泳時(shí)間30 min。瓊脂糖凝膠在302 nm利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。HPLC分析：Kromasil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm， 5

@ m），流動(dòng)相為甲醇-0.05%醋酸鈉（10∶90，V/V）溶液，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。以DMPO為自旋捕獲劑，捕獲自由基生成DMPO-#8226;OH加合物，利用ESR分析DNA損傷過(guò)程#8226;OH相對(duì)濃度變化。利用DPD法分析DNA損傷過(guò)程H2O2相對(duì)濃度變化。間時(shí)取樣1 mL加入到已裝好H2O2測(cè)定液（30

@ L POD， 1 mL pH 6.8 NaH2PO4-NaOH， 150 mL DPD）的比色管中，定容，靜置10 min，離心，取上清液在510 nm處進(jìn)行檢測(cè)。參照HJ/T 399-2007，測(cè)定DNA損傷過(guò)程化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand， COD）的變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 DNA損傷的電泳分析

電泳圖譜中DNA超螺旋（SC）、線性（L）和開(kāi)環(huán)（OC）3種形態(tài)分布可衡量DNA損傷程度。采用凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷程度，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著光催化輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA片段減少，DNA氧化損傷程度增加，尤其UV/TiO2輻照DNA時(shí)長(zhǎng)180 min時(shí)（泳道1），SC DNA已不存在，且未見(jiàn)L DNA及OC DNA形態(tài)，DNA完全損傷。

圖1 脫氧核糖核酸損傷的凝膠電泳圖像

Fig．1 Gel electrophoresis image of deoxyribonucleic acid (DNA) damage

泳道（Lane）1， 2， 3， 7： UV/TiO2 180， 120， 100， 60 min; 泳道（Lane）5： 11. DNA-MarkerⅢ; 泳道（Lane）4， 8： UV 100， 60 min; 泳道（Lane）9， 10： Dark/TiO2 60， 100 min; 泳道（Lane）6： None\\.

利用HPLC-紫外檢測(cè)器間時(shí)取樣分析DNA色譜譜圖（圖2a）。隨著光催化輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，保留時(shí)間為10.4 min的DNA物質(zhì)峰面積不斷減小；輻照時(shí)長(zhǎng)40 min樣品的色譜圖中出現(xiàn)損傷產(chǎn)物峰 （保留時(shí)間分別為12.0和20.4 min），隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA損傷產(chǎn)物峰面積呈先增加后減小的過(guò)程。

以8-OHdG為內(nèi)標(biāo)物，證明DNA損傷中間產(chǎn)物（保留時(shí)間為20.4 min）為8-OHdG。圖2 DNA損傷過(guò)程色譜譜圖（a）及DNA損傷及其損傷產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)曲線（b）

Fig．2 HPLC chromatogram of DNA damage （a） and kinetic curves of DNA damage and product （b）

1． 暗光激發(fā)TiO2催化體系DNA損傷動(dòng)力學(xué)曲線 （Kinetic curves of DNA damage under Dark/TiO2）; 2． 單純紫外光輻照體系（Kinetic curves of DNA damage under UV）; 3． 紫外光激發(fā)TiO2催化體系（Kinetic curves of DNA damage under UV/TiO2）; 4: DNA損傷產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)曲線（Kinetic curves of DNA damage product）。以DNA峰面積及其損傷產(chǎn)物8-OHdG峰面積對(duì)輻照時(shí)長(zhǎng)作圖，其動(dòng)力學(xué)變化曲線如圖2b所示。DNA氧化損傷程度為UV/TiO2＞UV＞Dark/TiO2。UV/TiO2體系DNA氧化損傷程度最大，輻照120 min DNA損傷99%，生成損傷產(chǎn)物8-OHdG濃度最高，其動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)為K=0.0165 min－1； 8-OHdG是先生成后消失的物質(zhì)，是DNA氧化損傷的中間產(chǎn)物之一。pH值對(duì)TiO2表面態(tài)、界面電位和表面電荷及聚集性均有明顯影響，同時(shí)TiO2濃度也影響光催化效率（圖3）。從圖3a可見(jiàn)，pH值近中性時(shí)，光催化導(dǎo)致DNA損傷程度最大。由圖3b可見(jiàn)，TiO2濃度為1.5 g/L時(shí)，輻照時(shí)長(zhǎng)30 min DNA損傷30%，光催化對(duì)DNA損傷程度最大。實(shí)驗(yàn)表明，DNA濃度10 mg/L，TiO2 濃度1.5 g/L、pH 7～8時(shí)，光催化反應(yīng)效率最高，DNA損傷嚴(yán)重。

圖3 底物pH （a）及TiO2濃度（b）對(duì)光催化引發(fā)DNA氧化損傷的影響?yīng)?/p>

Fig．3 Effect of pH （a） and TiO2 concentration （b） on DNA damage

3.2 DNA損傷過(guò)程氧化物種及H2O2相對(duì)濃度的分析

跟蹤DNA氧化損傷過(guò)程H2O2相對(duì)濃度的變化（圖4a）。檢測(cè)紫外光催化體系產(chǎn)生的#8226;OH波譜信號(hào)， 并比較不同體系產(chǎn)生#8226;OH相對(duì)強(qiáng)度變化的曲線（圖4b和圖4c）。

圖4 DNA氧化損傷過(guò)程H2O2相對(duì)濃度變化（a）、UV/TiO2體系DMPO-#8226;OH加合物的ESR波譜信號(hào)（b）及不同體系#8226;OH相對(duì)強(qiáng)度的比較（c）

Fig．4 Change of H2O2 concentration （a）， electron spin resonance （ESR） signals of 5，5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide

（DMPO） -#8226;OH adducts for UV/TiO2 system （b） and comparison of DMPO-#8226;OH intensity under different systems （c）

由圖4a可知，UV和Dark/TiO2體系不產(chǎn)生H2O2，DNA無(wú)損傷。但體系中引入紫外光并且有催化劑時(shí)，紫外光激發(fā)TiO2產(chǎn)生TiO2（e－），O2捕獲光生e－產(chǎn)生#8226;O－2自由基，#8226;O－2自由基與H＋在光生e－作用下生成大量H2O2，反應(yīng)8 h處H2O2的濃度最大。伴隨輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2經(jīng)紫外光分解或被光生e－還原轉(zhuǎn)化為#8226;OH。使用ESR檢測(cè)不同體系產(chǎn)生的#8226;OH波譜信號(hào)。UV/TiO2輻照DNA的ESR譜圖有一個(gè)四重峰，其強(qiáng)度比為1∶2∶2∶1，表明有#8226;OH生成（圖4b），同等條件UV/TiO2催化產(chǎn)生的DMPO-#8226;OH加合物的ESR信號(hào)強(qiáng)度比單純UV體系產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)（圖4c），且其特征信號(hào)峰強(qiáng)度具有逐漸減弱的趨勢(shì)。結(jié)果表明，UV/TiO2光催化作用介導(dǎo)產(chǎn)生大量的H2O2及#8226;OH，DNA氧化損傷涉及#8226;OH氧化歷程。

3.3 跟蹤DNA深度氧化歷程

通過(guò)跟蹤DNA氧化損傷過(guò)程化學(xué)需氧量（COD）的變化，評(píng)價(jià)DNA氧化損傷（礦化）的程度（圖5）。相對(duì)于Dark/TiO2體系而言，UV和UV/TiO2體系DNA的COD值都隨著輻照時(shí)間的增加而減少。 UV/TiO2輻照12 h DNA礦化率達(dá)83.37%，DNA的礦化程度高于單純UV輻照體系。結(jié)果表明，DNA損傷伴隨著深度氧化過(guò)程，最終氧化為CO2、H2O等小分子無(wú)機(jī)物。 圖5 DNA損傷過(guò)程化學(xué)需氧量的變化

Fig．5 Change of chemical oxygen demand in the process of DNA damage

3.4 羥基自由基引起的DNA氧化損傷作用機(jī)理

紫外光激發(fā)TiO2光催化作用產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化能力的#8226;OH，#8226;OH誘導(dǎo)DNA氧化損傷。鳥(niǎo)嘌呤是#8226;OH攻擊DNA結(jié)構(gòu)氧化損傷的首要位點(diǎn)， 8-OHdG是鳥(niǎo)嘌呤氧化損傷的特異產(chǎn)物。DNA損傷歷程：鳥(niǎo)嘌呤（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖6）自身發(fā)生氧化反應(yīng)， 轉(zhuǎn)移一個(gè)-H＋， 轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)嘌呤基團(tuán)，該基團(tuán)不穩(wěn)定，易與空氣中的氧與H＋結(jié)合為ROOH，伴隨體系重排反應(yīng)生成8-氧脫氧鳥(niǎo)嘌呤（8-OdG）。紫外光激發(fā)TiO2介導(dǎo)產(chǎn)生#8226;OH，8-OdG在#8226;OH作用下氧化損傷生成8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷8-OHdG，三者的結(jié)構(gòu)式如圖6所示。隨著光催化反應(yīng)的進(jìn)行，中間體8-OHdG在強(qiáng)氧化能力的氧化物種#8226;OH作用下深度氧化為CO2， H2O等小分子無(wú)機(jī)物。

圖6 鳥(niǎo)嘌呤及DNA損傷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式

Fig．6 Structures of guanine and damage products in DNA damage process

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Damage of Deoxyribonucleic Acid Caused by Hydroxyl Radical



WANG Xiao-Xing1， FANG Yan-Fen1， YANG Jing1， CHEN Deng-Xia1， 

HUANG Ying-Ping1， ZHANG Ai-Qing2

1（Engineering Research Center of Eco-environment in Three Gorges Reservoir Region，

Ministry of Education， China Three Gorges University， Yichang 443002）

2（Key Laboratory of Catalysis and Materials Science of Hubei Province，

South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074）

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Abstract Oxidative damage characteristic of Herring Sperm DNA by hydroxyl radical （#8226;OH） which was excited by TiO2 under UV irradiation （200－275 nm， 66.4 Lx） was studied. The process of DNA damage was detected by gel electrophoresis and high performance liquid chromatographic analysis. Electron spin resonance （ESR） and spectrophotometry were used to determine the oxygen species and the relative concentration of H2O2， respectively. The mechanism of DNA damage was studied using 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine （8-OHdG） as an internal standard. The results showed that DNA can be damaged by #8226;OH generated from photocatalysis. Compared with UV or Dark/TiO2 system， the degree of DNA damage reached the maximum in the UV/TiO2 system under the condition of DNA concentration 10 mg/L， TiO2 concentration 1.5 g/L and pH 7－8. The damage was caused by the process of #8226;OH oxidation of TiO2 under UV irradiation and deep mineralization of DNA took place. Guanine was easy to damage than the other groups in DNA. 8-OHdG was one intermediate product of DNA damage and a special product of guanine damage.

Keywords Deoxyribonucleic acid damage; Hydroxyl radical; Photocatalysis; 8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine

（Received 13 November 2010; Accepted 7 January 2011）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文