高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中20種磺酰脲類除草劑殘留

摘 要 建立了動物源性食品中20種磺酰脲類除草劑多殘留的分析方法。樣品經乙腈均質提取2次，經Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化后，在高效液相色譜-電噴霧串聯質譜儀多反應監測模式下測定，采用質譜法定性，外標法定量。除草劑采用Eclipse AAA色譜柱，以甲醇和0.1%乙酸溶液為流動相，在梯度洗脫條件下可以得到很好地分離。在6種動物源性食品中分別添加低、中、高3個濃度水平的20種磺酰脲類除草劑，平均回收率為66.07%～112.07%； 相對標準偏差為0.7%～19.4%； 20種磺酰脲藥物在6種動物源性食品中的檢出限為0.5～2.5

@ g/kg。本方法操作簡單、凈化效果好、靈敏度高，可應用于動物源性食品中20種磺酰脲類藥物的實際檢測分析。

關鍵詞 高效液相色譜-串聯質譜；磺酰脲類除草劑；動物源性食品

1 引 言

磺酰脲類農藥為選擇性內吸傳導型除草劑，通過抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）或乙酸羥酸合成酶（AHAS）的合成，從而阻止支鏈氨基酸的生物合成和阻止細胞的分裂和生長，達到除草的目的。磺酰脲類農藥以其高效、低毒、高選擇性等特點成為目前世界上使用量最大的一類除草劑。隨著該類除草劑使用范圍的擴大，其在農作物、環境和和動物源性食品中的殘留對人類健康的危害日益受到關注。日本制定了動物源性食品中多種磺酰脲類除草劑的最大殘留限量，如氟磺隆在豬肉和其它肉類的最大殘留限量均為0.05 mg/kg，砜嘧磺隆和丙苯磺隆在肝臟、豬肉、蛋和奶中的最大殘留限量均為0.004 mg/kg。我國對于動物源性食品中磺酰脲類農藥殘留的研究相對緩慢。因此，建立快速、有效的檢測動物源性食品中磺酰脲類除草劑殘留量的方法對食品安全、進出口貿易發展等方面都有重要意義。

目前，磺酰脲類農藥檢測方法有液相色譜法（HPLC），液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）和毛細管電泳法。前處理方法主要有固相萃取法、凝膠滲透色譜法等，涉及的基質主要是植物源性食品、水樣和土壤 等，對動物源性食品中磺酰脲類除草劑的殘留檢測鮮有報道。動物源性食品相對于植物源性食品、水樣和土壤而言，具有高脂肪、高蛋白質含量等特點，基質復雜，前處理過程中需多步凈化才能除去雜質和減少基質效應。因此，對動物源性食品中磺酰脲類除草劑的前處理條件優化中，不僅需要考慮對磺酰脲類農藥的提取效率，還需要動物源性食品基質中雜質如脂肪和蛋白質的去除效果，避免過高的基質抑制效應。本研究考察了有機溶劑以及凈化方法對磺酰脲類農藥的提取效率和凈化效果的影響，建立了前處理操作簡單，凈化效果良好，快速、準確、檢出限低的分析磺酰脲類除草劑殘留的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

API 4000三重四極桿質譜儀（美國應用生物系統公司），配電噴霧離子源；1100 型高效液相色譜儀（Agilent公司）；Eclipse AAA分析柱（150 mm×4.6 mm，5

@ m，Agilent公司）；2000切割式混合研磨儀（德國萊馳公司）；SK-1渦旋混勻器（富華儀器公司）；離心機（Sigma公司）；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL，Waters公司）。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；其它試劑均為分析純；水為Millipore超純水儀制備的超純水；20種磺酰脲類農藥標準品（純度均≥97%，德國Dr. S. Eherstorfer 公司），包括醚磺隆、甲基噻吩磺隆、丙苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、砜嘧磺隆、胺苯磺隆、酰嘧磺隆、甲磺胺磺隆、四唑嘧磺隆、嘧啶磺隆、碘甲磺隆鈉鹽、芐嘧磺隆、煙嘧磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、咪唑磺隆、氯嘧磺隆、甲基氟嘧磺隆和環丙嘧磺隆；分別準確稱取各標準品0.01 g（精確至0.01 mg），用丙酮溶解并定容至10 mL， 配制成1.0 g/L標準儲備液，4 ℃保存。取適量磺酰脲標準儲備液，用乙腈配制成適當濃度的混合標準工作溶液。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品提取 將豬肉、魚肉、雞肉、豬肝樣品用切割式混合研磨儀攪碎，雞蛋液攪勻。分別準確稱取豬肉、魚肉、雞肉和奶粉樣品各2.0 g，雞蛋和豬肝樣品各5.0 g （精確至0.01 g）于50 mL離心管中，依次加入3 mL水、10 mL乙腈，混勻3 min，加入1.0 g NaCl，繼續混勻1 min后，以7500 r/min離心3 min，吸取上層有機相于另一個試管中。在殘渣中加入5 mL乙腈重復提取一次，合并兩次提取液。用旋轉蒸發儀在35 ℃下旋蒸至近干，取3 mL丙酮-正己烷混合溶液（5∶95，V/V）溶解殘渣，待凈化。

2.2.2 樣品凈化 將Oasis HLB固相萃取小柱安裝在固相萃取的真空抽濾裝置上，依次用3 mL乙腈、3 mL水、3 mL丙酮-正己烷混合溶液（5∶95，V/V）預淋洗Oasis HLB固相萃取小柱，棄去全部預淋洗液，將上述待凈化液加到萃取柱上，棄去全部流出液，用6 mL乙腈洗脫萃取柱，保持流速0.5 mL/min，收集洗脫液，于35 ℃下以空氣吹至1.0 mL，過0.45

@ m有機濾膜后供液相色譜-串聯質譜儀測定。

分 析 化 學第39卷

第5期劉錦霞等：高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中20種磺酰脲類除草劑殘留

2.3 液相色譜與質譜條件

液相色譜條件： Eclipse AAA氨基酸分析柱（150 mm×4.6 mm i.d.，5

@ m）；流動相為甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～10.0 min，50%～80% A；10.0～14.0 min，80% A；14.0～20.0 min，50% A。流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10

@ L。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式；離子源溫度：350 ℃；噴霧電壓（IS）：5500 V；碰撞氣（CAD）：41.37 kPa；霧化氣（Gas1）：408 kPa；輔助氣（Gas2）：340 kPa；氣簾氣（CUR）：74.8 kPa；檢測方式為多離子反應監測模式（MRM）。定量離子對、定性離子對、去簇電壓、碰撞能量等質譜參數和各化合物的保留時間見表1。

3 結果與討論

3.1 質譜條件和液相色譜條件的優化

3.1.1 質譜條件優化 磺酰脲類化合物由芳環、磺酰脲橋和雜環三部分組成，具有仲氨基或叔氨基的化學電離性質，在ESI源中選擇正離子掃描模式，易獲得較高豐度的\\＋母離子。本研究采用正離子掃描模式，在確定各磺酰脲的母離子后，采用子離子掃描模式進行二級質譜分析。通過優化碰撞能量、去簇電壓、碰撞室入口和出口電壓等參數，使每種磺酰脲的母離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最佳。將高效液相色譜儀和三重四級桿質譜儀聯機，對離子源溫度、碰撞氣、霧化氣、輔助氣、噴霧電壓及氣簾氣進行優化（表1），使樣液中20種磺酰脲類化合物的離子化效率最佳。 圖1 20種磺酰脲類除草劑的總離子流圖

Fig．1 Total ion chromatograms of benzoylureas pesticides

圖中標記的1～20同表1（Nos.1－20 are the same as Table 1）.

3.1.2 液相色譜條件優化

磺酰脲類除草劑通常采用C18柱可以得到較好的分離效果。本實驗考察不同柱長的C18柱對磺酰脲類除草劑保留行為的影響。以Agilent Eclipse C18柱（250 mm×4.6 mm，5

@ m）為分離柱時，磺酰脲各組分峰形寬，峰形分叉，分析時間長；以Zorbox Eclipse AAA C18柱（150 mm×4.6 mm，5

@ m）為分離柱，以甲醇-水為流動相，并采用梯度洗脫時，15 min內即可使20種磺酰脲類藥物得到較好的分離，并獲得較高的靈敏度。在水相中加入0.1%乙酸，可以使色譜柱中的硅醇基質子化，消除硅醇基與磺酰脲類藥物的相互作用，減少拖尾，改善磺酰脲類藥物的峰形和分離效果。20種磺酰脲類農藥的總離子流圖見圖1。

3.2 樣品提取條件的優化

磺酰脲類藥物易溶于乙腈、丙酮、甲醇、氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑，根據各動物源食品中高脂肪、高蛋白含量的特點，本實驗以乙腈、丙酮、甲醇、氯仿4種有機溶劑為提取液，比較了不同提取溶劑對20種磺酰脲類除草劑提取效率的影響，結果見表2。從表2可見，乙腈對目標化合物的提取效率效果最好，提取效率均大于70%，甲醇的提取效率為22.4%～80.0%，而丙酮和氯仿對磺酰脲的提取效率更低，最低僅為14.5%。因此本方法選用乙腈作為提取劑，并且均質提取2次，提高對動物源性食品中殘留的磺酰脲類藥物提取效率。在加入乙腈和水混合溶劑時，加入適量NaCl，使水溶液飽和，不僅可以使乙腈和水相分層，還可以降低磺酰類藥物在水中的溶解度。因此，在提取過程中只提取有機溶劑層，可以去除溶解于水相中的雜質，起到凈化作用。

3.3 凈化方法的選擇及條件優化

3.3.1 凈化方法的選擇 采用CNWBOND LC-C18、SupelcleanTMENVI-CarbTM、Oasis HLB和GPC的凈化方法對豬肉基質進行凈化。實驗表明，SupelcleanTM ENVI-CarbTM吸附部分磺酰脲類目標化合物，造成回收率偏低（34.6%～69.1%）；反相吸附機理模式的Oasis HLB凈化效果最好，能基本去除豬肉基質中的干擾雜質。除了丙苯磺隆和酰嘧磺隆的回收率分別為68.5%和63.8%，其它藥物回收率均大于70%；CNWBOND LC-C18凈化效果與Oasis HLB相當，但對于甲基噻吩磺隆和四唑嘧磺隆的回收率明顯低于Oasis HLB，僅為49.1%和55.6%；GPC雖然能去除大分子的物質，但是許多小分子干擾物質仍被保留在收集液中，凈化效果不明顯，并且回收率均低于50%。因此，本實驗中選擇Oasis HLB固相萃取凈化方法。

3.3.2 凈化條件的優化 比較了甲醇、乙腈和丙酮-正己烷混合溶液（1∶1，V/V）的洗脫效果，及對20種磺酰脲類除草劑回收率的影響。用甲醇和丙酮-正己烷混合溶液洗脫時，均不能達到滿意的回收率效果。由于磺酰脲類化合物具有較強的極性，所以選擇極性較大的乙腈作為洗脫劑。3 mL乙腈能使磺酰脲類藥物的回收率均大于70%，6 mL乙腈能使部分磺酰脲類藥物回收率達到70.0%～98.7%，當乙腈用量為9 mL時，20種磺酰脲類藥物回收率無明顯改善。本研究選用6 mL乙腈作為洗脫劑。

3.4 線性范圍、標準曲線和檢出限

用乙腈稀釋混合標準工作液，配制5， 10， 20， 50， 100和200

@ g/L的系列標準溶液。分析物的峰面積與其濃度存在良好線性關系，相關系數（r）均大于0.998。采用空白基質中添加目標化合物的方法，按2.2節方法處理后進樣，在保證儀器檢出限和回收率穩定的情況下，本方法的檢出限為0.5

@ g/kg，其中嘧啶磺隆的檢出限為2.5

@ g/kg。

3.5 樣品的加標回收率和精密度

運用本方法在豬肉、魚肉、雞肉、豬肝、雞蛋和奶粉6種不同基質中添加2.5， 5.0和25.0

@ g/kg的20種磺酰脲類除草劑混合標準工作液。按照方法進行回收率實驗，每個添加濃度重復測定3次，計算添加回收率和測定結果的相對標準偏差，結果見表3。6種基質中磺酰脲添加回收率為66.1%～112.1%，3次測定結果的相對標準偏差為0.7%～19.4%。方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。

3.6 磺酰脲類除草劑在食物傳遞鏈中的代謝、積累過程討論

磺酰脲類除草劑對禾谷類作物安全性及其藥害研究表明，大劑量的用藥對玉米、小麥、谷子和高粱4種禾本科作物均有不同的藥害作用。湯凱潔等采用液相色譜-質譜聯用法檢測到大米中有芐嘧磺隆殘留。說明磺酰脲類除草劑在植物源性食品中存在殘留，同時，牲畜通過食入磺酰脲類除草劑殘留的糧谷或飼料，可能在其體內富集，通過食物鏈的傳遞和積累，人食用此類動物源性食品后，對人類的健康存在潛在的威脅。本研究建立的動物源性食品中磺酰脲類除草劑的檢測方法對于此類藥物的毒代動力學研究提供了方法依據。

3.7 實際樣品檢測

從本地超市中購買豬肉、魚肉、雞肉、奶粉、雞蛋和豬肝6種樣品，應用本方法進行測定，均未檢出磺酰脲類除草劑，說明磺酰脲類除草劑可能在動物源性食品中代謝，有關其代謝過程將進一步研究。

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Determination of 20 Sulfonylurea Herbicides Residues in Animal

Origin Foods by High Performance Liquid Chromatography-

Tandem Mass Spectrometry

LIU Jin-Xia1，2， ZHANG Yi1， DING Li1， LIU Xiao-Xia1，2， HUANG Zhi-Qiang*1， CHEN Bo2， WANG Li-Bing2

1（Hunan Academy of Inspection and Quarantine， Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection and

Quarantine Bureau， Hunan Key Laboratory of Food Safety Science Technology， Changsha 410004）

2（Hunan Normal University， Key laboratory of Chemical Biology Traditional Chinese Medicine Research，

Ministry of Education， Changsha 410081）

Abstract A method was developed for the determination of 20 sulfonylurea herbicides residues in animal origin foods by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Sulfonylurea herbicides were extracted with acetonitrile and the extract was cleaned up by Waters Oasis HLB solid phase extraction column. Qualitation of the analytes was achieved with multiple reaction monitoring （MRM） and external standard method was used for quantification. The chromatography separation was achieved in gradient mode， on a Eclipse AAA column using methanol and 0.1% acetic acid aqueous solution. The mean recoveries of 20 sulfonylurea herbicides varied from 66.1% to 112.1% in pork， fish， chicken， egg， pork liver and milk samples at three spiked levels. The relative standard deviations （RSDs） were in the range of 0.7%－19.4%. Depending on each herbicide pesticide， the limits of detection were in the range of 0.5－2.5

@ g/kg. The proposed method was successfully applied to the determination of sulfonylurea herbicides residues in animal-derived foods.

Keywords High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry; Sulfonylurea herbicides; Animal-derived food

（Received 24 August 2010; accepted 8 December 2010）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文