頂空低溫液相微萃取技術分析水中雜醇油和啤酒揮發性成分

摘 要 頂空液相微萃取 （HS-LPME）存在溶劑穩定性不高，只能采用沸點較高的溶劑，容易干擾樣品組分測定等缺點。頂空低溫液相微萃取裝置（HS-CLPME）以帶有臺階形圓柱腔體的聚四氟乙烯小帽為萃取劑的載體，利用半導體制冷技術（TEC）將萃取劑冷卻至最低－20 ℃，采用揮發性溶劑進行頂空液相微萃取（HS-CLPME），擴展了HS-LPME可選擇溶劑的范圍，減少了色譜圖上萃取劑峰與揮發性樣品峰的干擾，提高了頂空液相微萃取與氣相色譜的兼容性。由于萃取劑處于相對低溫，萃取性能得到提高。將HS-CLPME用于水中雜醇油的萃取分析，優化了萃取劑（乙腈）、離子強度（飽和NaCl濃度）、萃取劑體積（6

@ L）和溫度（－1 ℃）及樣品溫度（90 ℃）、攪拌速度（800 r/min）和萃取時間（45 min）等條件，對雜醇油的檢出限可達0.09～0.26

@ g/L； 富集倍數達78～198倍。將此技術用于啤酒樣品中的雜醇油和其它揮發性物質的分析，獲得了良好的結果。

關鍵詞 溫度控制-頂空液相微萃取； 半導體制冷； 氣相色譜； 雜醇油； 啤酒

1 引 言

液相微萃取技術（Liquid phase microextraction， LPME）由Jeannot等于1996年提出。LPME以懸掛在進樣針頭的微量體積的有機溶劑為萃取相，克服了SPME纖維昂貴、易折、使用壽命有限及交叉污染等缺點，在環境分析、生物分析、食品及藥物分析等領域廣泛應用。萃取劑可浸沒在樣品溶液中，也可懸掛在樣品上方（頂空模式）。

頂空-液相微萃取（Headspace liquid phase microextraction， HS-LPME）主要針對揮發性（VOCs）和半揮發性（SVOCs）的樣品富集。HS-LPME可以成功實施最重要的是萃取劑的選擇。除了對樣品有較高的富集能力之外，還要求有較大的表面張力和較高的沸點。由于萃取劑與微量進樣針的接觸面積較小，HS-LPME所能懸掛的體積一般為3～5

@ L，所能萃取的樣品量有限。另外，還要求所采用的萃取劑具有較高的沸點，如大于120 ℃，以避免在萃取樣品的過程中造成萃取劑的揮發。一般采用甲苯、正十二烷和正辛醇等。可采用鉤狀的中空纖維膜為溶劑的承載體，以提高穩定性；也可采用離子液體為萃取劑，并直接與氣相色譜聯用。當HS-LPME與氣相色譜聯用時，萃取劑在色譜圖上將產生較大的溶劑峰，嚴重干擾VOCs和SVOCs的定量分析。因此，傳統HS-LPME所能采用的萃取劑十分有限，極大限制了HS-LPME的應用。

為了克服上述缺點，本研究建立了可采用揮發性溶劑為萃取劑的頂空低溫液相微萃取裝置（Headspace cooled-liquid phase microextraction， HS-CLPME）。在本裝置中，以帶有臺階形圓柱腔體的聚四氟乙烯小帽為萃取劑的載體，利用半導體制冷技術將萃取劑冷卻至最低－20 ℃，擴展了HS-LPME可選擇溶劑的范圍。將HS-CLPME用于水中雜醇油和啤酒中揮發性成分的萃取分析，獲得了較好的結果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GC 6890N 氣相色譜儀（美國Agilent公司），配置分流/不分流進樣口和氫火焰離子化檢測器（FID）。7890A/5975C GC/MS氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司），配置分流/不分流進樣口和四級桿質譜檢測器。半導體溫度控制系統（自制，圖1）包括半導體制冷片（Thermoelectric cooler， TEC）、散熱片、風扇、制冷套、Pt100溫度傳感器、Jumo 702040高精度溫控表（德國Jumo公司）、直流電源和GTJ9固態繼電器（無錫天豪電子有限公司）。

2-戊醇（2-P-ol）、正丁醇（B-ol）、正戊醇（P-ol）、正己醇（H-ol）、丙酮、NaCl（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈、二氯甲烷（色譜純，Tedia公司）；實驗室用水為純凈水（杭州娃哈哈集團）。高級醇類標準樣品用甲醇配成1 g/L的混合標準溶液。

自來水和池塘水均取自大連化物所，水樣未經處理直接分析。啤酒樣品為某品牌干啤酒，用水按體積比1:5稀釋后直接分析。

2.2 樣品預處理條件和色譜條件

萃取模式：頂空萃取；萃取劑：6

@ L乙腈，－1 ℃；樣品溫度：90 ℃；攪拌速度：800 r/min；樣品條件：40 mL雜醇油溶液， 含飽和NaCl溶液；萃取時間：45 min。

色譜條件：萃取條件優化和水樣品中雜醇油的分析采用FFAP 毛細管柱（30 m×0.53 mm×1.0

@ m，大連科美精密儀器有限公司）；載氣：氫氣，流速5 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：280 ℃；程序升溫條件：初始溫度40 ℃ （保持5 min），以10 ℃/min升至100 ℃，再以15 ℃/min升至150 ℃ （保持3 min），最后以20 ℃/min升至220 ℃ （保持3 min） 。啤酒中雜醇油的分析采用FFAP 毛細管柱（30 m×0.32 mm×1.0

@ m，大連科美精密儀器有限公司）；載氣：氦氣，流速1.5 mL/min；程序升溫條件：初始溫度40 ℃ （保持11 min ），以10 ℃/min升至100 ℃，再以15 ℃/min升至150 ℃，最后以20 ℃/min升至200 ℃ （保持5 min）。其它條件同上。

2.3 HS-CLPME裝置

與傳統的頂空液相微萃取（HS-LPME）技術不同，HS-CLPME采用聚四氟乙烯小帽為萃取劑的承載體，可使用更多的萃取劑，同時利用TEC對萃取劑有效降溫并高精度控溫。HS-CLPME裝置圖見圖1，具體結構詳見文獻\\。其中聚四氟乙烯小帽是帶有臺階式腔體的樣品蓋，其材料為聚四氟乙烯。上部臺階式腔體結構由兩節圓柱形管組成，較粗管（8 mm×7 mm i.d.）在TEC作用下為水汽和樣品的分離通道；較細管（6 mm×3 mm i.d.）上端封閉，有機溶劑在其表面接觸作用下，可懸空而不流出。聚四氟乙烯帽所能承載的有機溶劑體積一般可達到20

@ L，遠大于傳統方式，且穩定性得到提高。半導體溫度控制系統與聚四氟乙烯小帽緊密配合，直接控制有機溶劑的溫度。在實驗室條件下，可使有機溶劑的溫度達到－10 ℃以下。 圖1 HS-CLPME的裝置操作示意圖

Fig．1 Schematic diagram of headspace cooled-liquid phase microextraction （HS-CLPME）

apparatus

1. 聚四氟乙烯小帽（PTFE vial cap with a cylindrical cavity）；2. 臺階式圓柱中空管（Cavity）；3. 較粗管（Transit region）； 4. 半導體制冷片（TEC）；5. 散熱片（Heatsink）；6. 風扇（Fan）；7. Pt-100 溫度傳感器（Pt-100 temperature sensor）； 8. 樣品瓶（Cylindrical vial）； 9. 磁力攪拌器（Magnetic stirrer with water bath）； a. 加入適量萃取劑（Adding extractant）；b. 帶有萃取劑的聚四氟乙烯小帽倒置后（萃取劑穩定懸掛）（PTFE vial cap with extractant steadily）；c. 將聚四氟乙烯小帽擰到樣品瓶上（Screwing the cap onto the sample vial）；

d. 將制冷系統置于聚四氟乙烯小帽上（Placing the cooling system onto PTFE vial cap）。

操作步驟：在聚四氟乙烯小帽的細管內加入適量萃取劑，將小帽倒置，并擰到樣品瓶上，此時萃取劑穩定于樣品的頂空部位。樣品瓶置于磁力攪拌器內，半導體制冷系統置于聚四氟乙烯帽上方，使其與頂部緊密配合。在制冷系統的作用下，有機溶劑將達到所設定的溫度。開啟磁力攪拌器，開始萃取。一定時間后，用微量進樣針取出1

@ L萃取劑進GC分析。

3 結果與討論

3.1 萃取劑的選擇

根據相似相容原理，雜醇油這類強極性的化合物需要采用極性溶劑為萃取劑。實驗中考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷和丙酮的萃取能力。結果表明，二氯甲烷和丙酮中存在與目標組分干擾的雜質，而乙腈比甲醇可萃取出更多的雜醇油，因此在實驗中都采用乙腈為萃取劑。

3.2 離子強度的影響

雜醇油在水中具有很大的溶解度，不利于頂空模式的萃取。增加水中的離子強度可以抑制醇類的電離，提高分子狀態的比例，降低極性化合物在水中的溶解度，使頂空氣相中極性化合物的濃度增加，進而增加萃取效果。在實驗中采取向水中加入NaCl方式增加樣品的離子強度。考察了NaCl濃度對萃取效率（以峰面積計，下同）的影響（圖2）。當NaCl為飽和濃度時整體萃取效率最好。



3.3 萃取劑體積的選擇

按照平衡狀態的頂空液相微萃取理論，萃取劑體積越大，可萃取出更多的樣品。但在實際操作過程中，HS-LPME過程多為非平衡過程，而且對采用氣相色譜作為萃取后的分離手段。因此，萃取劑的體積存在最佳值。實驗表明，當萃取劑乙腈的體積為5

@ L時，萃取后剩余的溶劑體積小于1

@ L，因此舍去此實驗；萃取劑乙腈的體積在6～13

@ L范圍時，6

@ L乙腈可獲得最高的萃取效率，見圖 3。

圖2 離子強度對萃取效率的影響

Fig．2 Effect of ionic intensity on extraction efficiency

圖3 萃取劑體積對萃取效率的影響

Fig．3 Effect of solvent volumn on extraction efficiency

3.4 溶劑溫度的影響

考察了溶劑溫度對萃取效率的影響（圖4）。結果表明，當制冷系統的溫度高于0 ℃時，水樣中大量水蒸汽很容易進入聚四氟乙

圖4 溶劑溫度（a）和樣品溫度（b）對萃取效率的影響

Fig．4 Effect of solvent temperature （a） and sample temprature （b） on extraction efficiency

烯小帽的頂端冷凝成水，與萃取劑混合，萃取過程無法進行。當制冷系統的溫度低于0 ℃時，可有效減少水蒸氣進入萃取劑的概率，大部分水蒸氣和樣品在較粗管內已實現分離，使得萃取過程得以進行。樣品的峰面積隨溫度的降低而減小，其原因可能是在低溫時，揮發的醇樣品有部分溶入冷凝的水蒸汽里，樣品在乙腈中溶解量減少。因此溶劑溫度選擇為－1 ℃。



3.5 樣品溫度的選擇

考察了50～90 ℃的樣品溫度對萃取效率的影響。結果表明，整體萃取效率隨溫度的升高而增加，在90 ℃時基本趨于平衡。因此樣品溫度選擇為90 ℃。 圖5 萃取時間的優化

Fig．5 Effect of extraction time on extraction efficiency

3.6 樣品攪拌速度的選擇

提高攪拌速度可以增加樣品在水中的擴散速度，從而加快樣品進入頂空相，增加萃取效率。峰面積在攪拌速度到達800 r/min后，基本不再增加。因此最佳攪拌速度選擇800 r/min。

3.7 萃取時間的優化

從圖5可見，萃取效率隨萃取時間的延長而增加，同時HS-CLPME對雜醇油類的萃取遠未達到平衡狀態。這可能與樣品體積有較大關系。另外，HS-CLPME的裝置很難達到萃取平衡。本實驗將萃取時間選定為45 min，根據非平衡理論進行定量分析。

3.8 HS-CLPME萃取性能考察

采用HS-CLPME裝置在上述優化條件下萃取1 mg/L雜醇油類標樣溶液，用GC-FID檢測，分別考察了HS-CLPME對雜醇油的檢出限（LODs）、線性范圍、相關系數（r）和重現性（RSD）。其中LODs是按3倍信噪比計算，結果列于表1。

Fig．6 TIC of beer by HS-CLPME/GC-MS

a． 乙酸乙酯（Ethyl acetate）； b. 丁酸乙酯（Ethyl butyrate）； e. 乙酸異丁酯（Isobutyl acetate）； f. 2-甲基丁醇（2-Methyl-1-butanol）； g. 己酸乙酯（Ethyl hexoate）； h. 辛酸乙酯（Ethyl octanoate）。

比較文獻\\和\\中所報道的對醇類萃取的LODs（表1），HS-CLPME的LOD比以前報道的結果低很多（約1/10）。文獻\\所采用的方法是動態頂空液相微萃取技術，文獻\\采用的是自制OH-TSO-BMA-DVB共聚物涂層的SPME技術。HS-CLPME的另一個優點是萃取劑是每次更換的，不存在SPME的“記憶效應”，同時也不需要動態頂空液相微萃取所需的機械動力裝置。

3.9 HS-CLPME在實際水樣和啤酒分析中的應用

采用HS-CLPME技術，在優化的條件下分別對自來水和池塘水中的雜醇油類物質進行萃取分析。兩種水樣均未發現目標組分。在兩種水樣中添加雜醇油（最終濃度為1 mg/L），考察方法的加標回收率。自來水樣品的加標回收率在106.2%～112.1%之間; 池塘水的加標回收率在102.1%～106.3%之間。

將HS-CLPME技術應用于某品牌的啤酒中揮發性成分的分析，其色譜圖見圖6。測出8種物質，對其中5種物質進行了定性分析。

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

A Headspace Cooled-liquid Phase Microextraction Technique and

Its Application for Analysis of Fusel Oil in Water Samples and

Volatile Compounds in Beer



CHEN Shi-Heng1，2， WANG Jian-Wei1， LI Wei-Wei1， PENG Hong1， GUAN Ya-Feng1

1（Department of Instrumentation Analytical Chemistry， Key Laboratory of Separation Science for

Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences，

National Chromatographic R.A. Center， Dalian 116023）

2（Graduate School of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100039）



Abstract A novel Headspace cooled-liquid phase microextraction（HS-CLPME） has been developed and demonstrated. A polytetrafluoroethylene vial cap with a two-step cylindrical cavity was used as solvent drop holder， and a cooling system based on thermoelectric cooler （TEC） was used to lower the temperature of solvent drop to subzero. Volatile solvents can be used as extractant in HS-CLPME， which extends the selection of extractant for HS-LPME， reduces the interference of the large solvent peak to the analytes peaks， and enhances the compatibility of HS-LPME with gas chromatograph （GC）. Because of the relatively lower temperature of extractant， the extraction efficiency has been improved. HS-CLPME was applied to analyze the fusel oil in water. The operation parameters including the ionic intensity， the volume and temperature of extractant， the sample temperature， stirring rate， and extraction time were optimized. The limits of detections ranged from 0.09

@ g/L to 0.26

@ g/L for fusel oil， and the enrichment factors were from 78 to 198. The HS-CLPME was also applied to analyze volatile flavors in beer.

Keywords Headspace cooled-liquid phase microextraction; Thermoelectric cooler; Gas chromato-graphy; Fusel oil; Beer

（Received 9 September 2010; accepted 9 November 2010）