超高效液相色譜-串聯質譜快速篩查葡萄酒中的14種禁用食品添加劑

摘 要 建立了同時測定葡萄酒中14種禁用食品添加劑的超高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜（UPLC-ESI-MS/MS）分析方法。采用UPLC BEH C18 （100 mm × 2.1 mm × 1.7色譜柱， 對流動相的組成、緩沖液離子強度及質譜的各種參數進行了優化。結果表明，流動相的離子強度對食品添加劑的質譜檢測有重要影響，以含1 mmol/L甲酸銨-甲酸緩沖液（pH 3.9）-乙腈為流動相， 梯度洗脫，柱溫35 ℃，可以在6 min 內完成14種食品添加劑的分離和檢測。在ESI負離子模式下，采用選擇離子監測方法進行測定時，除三氯蔗糖、日落黃和酸性紅13的檢出限分別為10，2和2之間。回收率為93.8%～106%，相對標準偏差小于3.1%。本方法快速、準確、靈敏度高，可用于葡萄酒及其它復雜基質食品中的低劑量、多種禁用食品添加劑的同時篩查。

關鍵詞 超高效液相色譜；串聯質譜；食品添加劑；葡萄酒

1 引 言

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經發酵而成，富含有機酸、糖類、黃酮類、酚類和原花青素等功能成分，適量飲用能夠預防多種疾病[1，2]。國家標準GB2760-2007《食品添加劑使用衛生標準》在葡萄酒中僅允許添加焦糖色作為著色劑，三氯蔗糖作為甜味劑，除此之外禁止添加任何種類的著色劑和甜味劑[3]。近年來，在葡萄酒中添加非法著色劑和甜味劑的情況時有發生，為了保障葡萄酒的飲用安全，有必要建立一種快速、準確、靈敏的方法對葡萄酒中的禁用食品添加劑進行測定。

目前，檢測食品中著色劑和甜味劑的方法有高效液相色譜[4，5]、紫外分光光度法[6]、離子色譜法[7]、毛細管電泳法[8～10]及液相色譜-質譜法[11～15]等。由于使用液相色譜-紫外分光光度法不能提供結構信息，而葡萄酒成分又較復雜，因而在檢測微量成分時容易發生假陽性或假陰性現象。近年來，質譜技術已在食品中添加劑的篩查方面顯現出顯著優勢[13，14]。然而目前所報道的質譜方法多采用傳統的色譜條件，其中所用的醋酸銨或是甲酸銨溶液緩沖液濃度多大于20 mmol/L[12～14]。研究表明，過高的離子濃度對分析物的電離具有較強的抑制作用[16，17]。因此，為提高檢測的靈敏度，增強對食品中禁用物質的篩查能力，有必要對質譜分析時緩沖液的濃度進行優化。本研究建立了同時高靈敏、快速篩查葡萄酒中14種禁用甜味劑和著色劑的超高效液相色譜（UPLC）-串聯三重四極桿質譜（QQQ）方法，對色譜分離中緩沖液的濃度對質譜檢測的靈敏度的影響進行了探討。本方法已成功用于葡萄酒中禁用添加劑的快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（UPLC，美國Waters公司）；串聯API 5500三重四極桿質譜儀（美國Applied Biosystems公司），配備Waters UPLC 自動進樣器，柱溫箱，數據采集由Analyst 1.5.1 軟件完成。

糖精鈉（Sodium saccharin）、安賽蜜（Acesulfame）、阿斯巴甜（Aspartame）， 購自美國Supelco公司；甜蜜素（Sodium cyclamate）、紐甜（Neotame）、麗春紅2R（Ponceau 2R）、麗春紅3R（Ponceau 3R）、麗春紅SX（Ponceau SX）， 購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；三氯蔗糖（Sucralose）、日落黃（Sunset Yellow FCF）、誘惑紅（Allura Red）、紅色2G（Acid Red 1）、酸性紅13（Acid Red 13）、赤蘚紅（Erythrosine）、甲酸、甲酸銨，購自美國Sigma公司；實驗室用水由Millipore純水儀制備。10份葡萄酒樣品購自超市。

2.2 標準溶液的配制

準確稱取適量上述標準品，用水溶解并定容，配制成1000 mg/L的單標儲備液；準確移取各標準儲備液0.5 mL，混合于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成5 mg/L的混合標準工作液。用水逐級稀釋，制成濃度范圍為0.1～500

3 結果與討論

3.1 流動相條件優化

文獻[12]報道，采用高效液相色譜-串聯質譜檢測葡萄酒中5種甜味劑時，這些甜味劑在甲醇-20 mmol/L甲酸銨-甲酸體系的保留時間與甲醇-20 mmol/L醋酸銨-醋酸體系一致，同時部分甜味劑的靈敏度提高了15倍以上，這說明甲酸銨體系可以獲得比醋酸銨體系更高的靈敏度。Storm等[16]的研究表明，溶液中的NH4＋濃度嚴重影響質譜檢測的靈敏度。Minioti等[5]的研究表明，使用乙腈分離著色劑可以獲得比甲醇更好的峰對稱性。因此，本研究以乙腈-20 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸，pH 3.9）為流動相，對所研究的14種食品添加劑的分離條件進行了優化，14種添加劑可以在6 min內得到較好分離（見圖1）。

考察了緩沖液的濃度對添加劑的信號強度的影響。選用的甲酸銨-甲酸（pH 3.9）緩沖液的離子濃度分別為20， 10， 5， 2.5 和 1 mmol/L。研究表明，隨著緩沖液濃度的降低，溶液中的離子強度相應降低（圖2），但各添加劑的保留時間基本不變，這說明離子強度的降低并未對待分析物的分離度產生影響。然而，待分析物的峰高卻顯著提高（見圖3）。由于部分著色劑未實現基線分離，為避免相互間的競爭抑制效應對分析結果的影響，在此僅以6種甜味劑的峰高的變化對其進行表征。從圖3可見，6種甜味劑的信號強度隨流動相離子強度的降低而不斷提高，這說明過高的離子強度確實對添加劑的質譜檢測有離子抑制作用。為取得最高的靈敏度，本研究選擇乙腈-1 mmol/L甲酸銨-甲酸體系作為14種添加劑的分離體系。

References

1 ZHAO Ren-Jun（趙任軍）. Sino-overseas Grapevine and Wine（中外葡萄與葡萄酒）， 2006， 2（5）: 51～53

2 XIE Ya-Li， CHEN Xin-Xin， FENG Yong， YANG Bin（謝婭黎，陳欣欣，馮 勇，楊 彬）. Modern Food Science and Technology（現代食品科技）， 2009， 35（12）: 1482～1483

3 GB2760-2007. Hygienic Standards for Uses of Food Additives（食品添加劑使用衛生標準）. National Standards of the People's Republic of China （中華人民共和國國家標準）. Beijing（北京）: Standards Press of China（中國標準出版社）， 2007 

4 Minioti K S，Sakellariou C F，Thomaidis N S. Anal. Chim. Acta， 2007， 583（1）: 103～110

5 YANG Liu-Hua， WANG Lin， SUN Cheng-Jun（楊柳樺，王 林，孫成均）. Chinese Journal of Analysis Laboratory（分析試驗室）， 2007， 26（7）: 79～82

6 ZHUO Jing， WANG Jing， CHEN Xiao-Xia， TANG Xin-Hua， QIU Bin， ZHU Er-Yi， CHEN Xi（卓 婧， 王 靜， 陳小霞， 邱彬， 朱爾一， 陳 曦）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2011， 39（2）： 283～287

7 Chen Q C， Mou S F， Liu K N， Yang Z Y， Ni Z M. J Chromatogr. A， 1997， 771（1）: 135～143

8 Zhu Y， Guo Y Y， Ye M L， James F S. J. Chromatogr. A， 2005， 1085（1）: 143～146

9 Dossi N， Toniolo R， Pizzariello A， Susmel S， Perennes F， Bontempelli G. J. Electroanal. Chem.， 2007， 601（1-2）: 1～2

10 Ryvolová M， Táborsky P， Vrábel P， Krásensky P， Preisler J. J. Chromatogr. A， 2007， 1141（2）: 206～211

11 SHENG Xuan， CHEN Chang-Jun， DING Zhen-Hua， SUN Jan-Wen， DING Yan-Sheng， ZHENG Ping（盛 旋， 陳昌駿， 丁振華， 孫建文， 丁袁生， 鄭 屏）. Chinese Journal of Analysis Laboratory（分析試驗室）， 2006， 25（7）: 75～78

12 JI Chao， FENG Feng， CHEN Zheng-Xing， SUN Li，CHU Xiao-Gang（嵇 超，馮 峰，陳正行，孫 利，儲曉剛）. Chinese Journal of Chramatography（色譜）， 2010， 28（8）: 749～753

13 QIN Fang， WANG Lin-Xiang， TAO Guan-Jun（秦 昉，王林祥，陶冠軍）. Liquor-Making Science Technology（釀酒科技）. 2005， 21（9）: 84～86

14 Ma M， Luo X， Chen B， Su S， Yao S. J. Chromatogr. A， 2006， 1103（1）: 170～176

15 Sun H W， Wang F C， Ai L F. J. Chromatogr. A， 2007， 1164（1-2）: 120～128

16 Storm T，Reemtsma T， Jekel M. J. Chromatogr. A， 1999， 854（1-2）: 175～185

17 Holapek M， Jandera P， Zderadika P. J. Chromatogr. A， 2001， 926（1）: 175～186

Simultaneous Screening of 14 Illegal Food Additives in Wines

Using Ultra Performance Liquid Chromatography

Tandem Mass Spectrometry

FENG Feng1， YANG Shuo2， LING Yun1， JIANG Gui-Bin3， CHU Xiao-Gang*1

1（Institute of Food Safety， Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）

2（Harbin Medical University， Harbin 150081）

3（State Key laboratory of Environmental Chemistry and Eco-toxicology， Research Center for

Eco-Environmental Sciences， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100085）

Abstract An ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric （UPLC-ESI-MS/MS） method for the simultaneous screening 14 illegal food additives （acesulfame， sodium saccharin， sodium cyclamate， aspartame， neotame， sucralose， ponceau 2R， ponceau 3R， ponceau SX， sunset yellow FCF， allura red， acid Red 1， acid red 13， erythrosine） in wines has been developed. The HPLC separation was carried out using an UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7