高效毛細管電泳法同時測定減肥類功能食品中7種違禁成分

摘 要 建立了同時測定減肥類功能食品中違禁成分芬氟拉明、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、安非拉酮、西布曲明、西地那非和士的寧的高效毛細管電泳分析方法。以20 mmol/L硼砂-10 mmol/L SDS-5%乙腈溶液（pH 9.0）為運行緩沖液，在25 ℃，17 kV條件下測定，檢測波長為195 nm。各待測物線性范圍上限均為100 mg/L，線性相關系數均大于0.998，相對標準偏差為4.5%～7.9%（n＝7）; 平均加標回收率為79.6%～112.0%; 檢出限（S/N＝3）為0.16～0.65 mg/L。本方法簡便快速、靈敏準確、分析成本低，已成功應用于功能食品中上述減肥類違禁添加成分的測定。

關鍵詞 高效毛細管電泳法；減肥功能食品；違禁成分

1 引 言

功能食品也稱保健食品，是指具有保健或預防疾病功效的加工食品。個別生產商為使功能食品在短時間內達到所宣稱的效果，違法加入一種或多種具有相應功能的違禁藥物，如芬氟拉明（Fenfluramine）[1]、偽麻黃堿（Pseudoephedrine）[2]、去甲偽麻黃堿（Norpseudoephedrine）[2]、安非拉酮（Amfepramone）[3]、西布曲明（Sibutramine）[1]、西地那非（Sildenafil）[4]和士的寧（Strychnine）[5]等。這些非法添加成分對人體健康危害極大。我國和美國、日本等都有因食用了添加這些違禁成分的功能食品而致死的報道。因此，為保護消費者的健康，有效監督功能食品質量，有必要建立功能食品中多種違禁添加成分同時快速檢測方法。

目前，對上述化合物的單獨測定或某幾個化合物同時測定方法較多，主要有液相色譜法[6～10]，液相色譜-質譜法[11～13]和氣相色譜-質譜法[14，15]等。高效毛細管電泳法（HPCE）是近年發展快速的一種分析技術，是經典電泳技術和現代微柱技術相結合的產物，與HPLC及LC-MS相比較，具有分離能力強、操作簡便和分析成本低廉等優點。李潤鍇等[16]使用HPCE法測定了性保健品中的西地那非，楚清脆等[17]應用HPCE法測定了感冒藥中的鹽酸偽麻黃堿，但采用HPCE法同時測定功能食品中上述7種化合物未見報道。本研究通過固相萃取凈化、毛細管電泳分離、紫外檢測，建立了快速檢測減肥類功能食品中上述7種違禁添加成分的分析方法，用于實際樣品的測定，結果滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

濾膜過濾后，取4 mL待固相萃取凈化。固相萃取小柱依次以3 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液和3 mL 2%甲酸溶液活化。上樣后，依次用2 mL 2%甲酸溶液，2 mL 30%甲醇溶液，1 mL甲醇淋洗雜質和色素。此后用6 mL 2%氨水-甲醇溶液（臨用新配）洗脫待測物，收集洗脫液。固相萃取過程不施加真空，滴速不超過5 mL/min。淋洗液于40 ℃水浴中由弱氮氣吹至近干，以0.01 mol/L HCl溶解并定容至0.20 mL，以10000 r/min離心后供HPCE測定。

2.3 電泳條件

毛細管在使用前，依次用純水、0.1 mol/L NaOH、純水、緩沖液加壓沖洗各3 min。測定時，設置溫度25 ℃，17 kV，檢測波長195 nm。每次分析結束后，緩沖液加壓沖洗3 min，再進行下一次分析。壓力差（重力）進樣13 s。

2.4 標準系列的制備

以100 mg/L的標準應用液配制5.0，10.0，25.0，50.0，75.0和100 mg/L混合標準系列溶液。

2.5 定性與定量分析

以遷移時間定性，外標標準曲線法定量。以違禁添加成分標準溶液質量濃度對峰面積進行線性回歸得回歸方程。根據試樣的峰面積由回歸方程計算得進樣液中待測違禁成分的質量濃度，再根據稱樣量及稀釋倍數，計算樣品中待測違禁成分的含量（以mg/kg表示）。

3 結果與討論

3.1 最佳電泳條件的選擇

3.1.1 緩沖液及其pH 為改善峰型和分離效果，消除溶劑峰對分離的影響，加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）[18]。SDS具有吸附、增溶、形成膠束等功能。可用作疏水溶質的助溶劑、離子對試劑或管壁表面改性劑，還可影響電滲流。當加入SDS的量超過其臨界膠束濃度（8.2 mmol/L）時，其在水中聚成球形膠束，電荷朝外，烷基藏于內部，其作用類似于色譜固定相。此時，毛細管電泳分離方式發生改變，成為膠束電動毛細管色譜（MEKC或MECC）。實驗考察了不同濃度SDS對分離的影響，發現隨SDS濃度的增加，分離度提高，溶劑峰提前，但遷移時間延長（圖1中a和b）。當加入SDS超過其臨界膠束濃度達到10 mmol/L時，7種待測成分均完全分離（圖1c）。綜合考慮分離度及分析時間，最后確定SDS的濃度為10 mmol/L。此時，毛細管電泳的分離模式為MEKC。實驗中加入不同量乙腈觀察其峰形的影響，結果表明，乙腈對分離度影響不明顯，但可改善峰形。當其含量為5%時，峰形最佳。

加入0.1 mol/L HCl調節運行緩沖液pH值，發現隨著pH值降低，鹽酸偽麻黃堿與去甲偽麻黃堿的分離度下降。考慮到運行緩沖液本身pH≈9.0，而過高pH值會縮短毛細管使用壽命，故未通過調節pH值改善分離度。

3.1.2 進樣時間 采用壓力差進樣，進樣時間影響方法的靈敏度。考察了10～15 s內峰面積的變化。在10～13 s，隨著進樣時間增加，峰面積變大，靈敏度增加，且分離效果穩定；13～15 s，由于進樣體積變大，進樣時間延長，峰形變寬，分析物出現擴散，分離度變差。故進樣時間選擇為13 s。

3.1.3 分離電壓 溫度的改變可引起遷移時間及分離度的變化[18]。將溫度控制在25 ℃。在25 ℃下，考察了電壓對分離效果的影響，在11～20 kV范圍內，隨著電壓升高，遷移時間縮短。在17 kV時，各化合物均得到良好分離。故分離電壓選擇為17 kV。

3.2 樣品前處理方法

功能食品組成復雜，特別是以減肥茶等樣品基體干擾嚴重。為消除干擾，提高靈敏度，采取固相萃取的方法凈化樣品。因被測物質均為有機弱堿，所以，可用弱酸水溶液提取，然后用強陽離子交換柱凈化樣品，由氨化甲醇洗脫被測物。

SPE柱經活化后上樣，為盡量洗去色素等雜質，先用2%甲酸溶液淋洗，但不能完全洗去，又嘗試使用甲醇淋洗。結果表明，隨著甲醇比例的增加，色素等雜質越易淋洗掉。但甲醇含量過高，又使西布曲明被洗脫，造成損失。當用2 mL 30%甲醇淋洗時，再加上1 mL純甲醇，能使色素等雜質基本洗脫，而又不使被測物流出，故本法確定的固相萃取淋洗時依次用2 mL 2%甲酸、2 mL 30%甲醇和1 mL甲醇淋洗雜質和色素。此后用6 mL 2%氨水-甲醇溶液（臨用新配）淋洗待測物。

比較了3種不同濃度（0.5%， 2%和5%）氨化甲醇對7種待測組分的洗脫效率。結果表明，3種濃度洗脫液均能完全洗脫待測組分。但隨著氨水比例增加，洗脫體積減小，但基體干擾增大，綜合考慮選取6 mL 2%氨化甲醇作為洗脫液。此時各待測物洗脫率為芬氟拉明93.4%，去甲偽97.8%，偽麻黃堿93.8%，安非拉酮97.5%，西布曲明94.1%，士的寧95.1%，西地那非97.8%。

3.3 方法線性回歸方程、檢出限和精密度

配制0，5.00，10.0，25.0，50.0，75.0和100 mg/L混合標準溶液，以峰面積（y）對含量（x）進行線性回歸，各組分的線性相關系數均大于0.998，表明7種違禁成分在0～100 mg/L范圍內呈良好的線性關系。以基線噪聲的3倍響應值對應的標準溶液含量計算得各組分方法檢出限為0.16～0.65 mg/L。在同樣條件下測得日內及日間精密度結果見表1。

3.4 方法回收率

對實際樣品進行加標回收實驗。取適量樣品混勻，稱取12份平行樣，其中3份用作本底測定，其余9份按高、中、低水平加入各組分標準溶液，然后以2.2節進行樣品處理和測定，測得的加標回收率見表2。

3.5 樣品分析

用本法對不同廠家的7種樣品，包括3種減肥膠囊，2種減肥茶和2種減肥片進行了檢測。在某膠囊樣品中檢出西地那非，含量為56 mg/kg；另一減肥茶樣品中測出芬氟拉明，含量為7 mg/kg。

本研究報道的HPCE法具有簡便、快速、準確、成本低等特點。樣品經SPE凈化濃縮后，可消除大部分干擾，且靈敏度顯著提高，適用于減肥類功能食品中違禁成分的分析。

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Simultaneous Determination of Seven Adulterants in Slimming Functional

Foods by High Performance Capillary Electrophoresis

LI Yang， XUE Feng， WANG Yuan， XUE Yong， SUN Cheng-Jun*

（West China School of Public Health， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract A method for the simultaneous determination of seven adulterants including fenfluramine， pseudoephedrine， norpseudoephedrine， amfepramone， sibutramine， sildenafil and strychnine in slimming functional foods has been established. A mixture of 20 mmol/L sodium tetraborate-10 mmol/L SDS-5% acetonitrile was used as running buffer （pH 9.0）. The samples were analyzed by high performance capillary elctrophoresis under conditions of 17 kV; 25 ℃ with the detection wavelength of 195 nm. The upper limits of linear ranges were all 100 mg/L with linear correlation coefficients greater than 0.998. The RSDs were 4.5%－7.9% （n＝7）. The average recoveries were 79.6%－112.0%. The detection limits （S/N＝3） were 0.16－0.65 mg/L. The method is simple， fast， sensitive， accurate， low cost and has been successfully applied to the determination of the 7 target chemicals in the slimming functional foods.

Keywords High performance capillary electrophoresis; Slimming functional foods; Adulterant