毛細(xì)管電泳法檢測(cè)癌基因C-myc胃癌中基因點(diǎn)突變

摘 要 癌基因C-myc激活和突變?cè)谖赴┬纬蛇^(guò)程中起著重要作用。通過(guò)毛細(xì)管電泳（CE）方法檢測(cè)50例胃癌患者中C-myc基因突變，建立一種準(zhǔn)確、快速診斷早期胃癌的方法。本實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增胃癌及癌旁正常組織中C-myc基因第二外顯子易發(fā)突變的部位基因序列，擴(kuò)增樣品分別經(jīng)96 ℃變性和EcoRⅤ酶切處理，以PAGE-SSCP， CE-SSCP， CE-RFLP分別對(duì)其突變情況進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)化的CE檢測(cè)條件：篩分介質(zhì)PEO濃度3.0%，pH 8.2，電壓15 kV，溫度15 ℃；熒光檢測(cè)：λex＝488 nm， λem＝520 nm。檢測(cè)結(jié)果：C-myc基因總突變率為20.0%（10/50）。測(cè)序分析結(jié)果顯示C-myc基因第二外顯子第53密碼子存在點(diǎn)突變，堿基A變?yōu)閴A基T（GAT→GTT），堿基的改變使氨基酸由亮氨酸替代為谷氨酰胺。本研究數(shù)據(jù)證實(shí)C-myc基因突變與胃癌的形成緊密相關(guān)，CE檢測(cè)C-myc突變基因可作為胃癌早期診斷的簡(jiǎn)便可靠的方法。

關(guān)鍵詞 胃癌； C-myc； 突變； 毛細(xì)管電泳； 單鏈構(gòu)象多態(tài)性； 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

1 引 言

基因突變的檢測(cè)在臨床疾病診斷中起十分重要的作用。目前，篩查基因點(diǎn)突變常常采用以PCR為基礎(chǔ)的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，這些方法在滿足臨床快速檢測(cè)基因突變的需要時(shí)有一定的局限性。毛細(xì)管電泳（CE）是一種新型的電泳分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[1，2]，成為分離DNA 片段的重要方法之一。CE 與單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等各種基因突變檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合時(shí)，顯示了一定的優(yōu)越性，并已成功用于基因突變點(diǎn)的檢測(cè)[3～9]。盡管文獻(xiàn)已有報(bào)道應(yīng)用其它的方法對(duì)C-myc基因在胃癌中作用情況進(jìn)行了研究，但是采用CE結(jié)合SSCP、RFLP檢測(cè)胃癌中C-myc基因突變點(diǎn)的文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。

胃癌在我國(guó)是消化道高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居各種惡性腫瘤之首[10，11]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種癌基因、抑癌基因及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因變化的積累，以及基因的不穩(wěn)定性等變化，其中位于人類第8號(hào)染色體q24區(qū)帶上的癌基因C-myc突變，與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系[12]，檢測(cè)其突變對(duì)于確定腫瘤病因判斷預(yù)后等有重要意義。C-myc激活表現(xiàn)為基因突變和染色體異位。有研究認(rèn)為[13～15]C-myc癌基因具有刺激細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用，其作用的選擇是由其他信號(hào)，如生長(zhǎng)因子等因素的存在或其他存活刺激所決定。本實(shí)驗(yàn)中C-myc基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，通過(guò)SSCP， RFLP結(jié)合CE分別對(duì)C-myc基因突變情況進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討C-myc基因突變和胃癌的關(guān)系，建立檢測(cè)胃癌中C-myc基因突變方法，為科學(xué)準(zhǔn)確的胃癌早期診斷奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

P /ACE System 5000型毛細(xì)管電泳儀、P/ACE System 5000 station數(shù)據(jù)處理軟件、P/ACE System laser module 488 nm激光發(fā)射器（美國(guó)Beckman公司）；石英毛細(xì)管柱（河北永年光導(dǎo)纖維廠）；PCR擴(kuò)增儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）。

聚環(huán)氧乙烷（ PEO， Mw＝300000）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ（ Fermentas）；丙烯酰胺（Genview）、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨（APS）均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷（MAPS）（A Johnson Matthey公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris， 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、硼酸（天津化學(xué)試劑廠）；TaqDNA 聚合酶、PCR 試劑（Bio Basic inc）；SYBR GreenⅠ核酸染料（10000×，50

混勻后，負(fù)極10 V電動(dòng)進(jìn)樣30 s。采用實(shí)驗(yàn)室已確定的PEO分離pUC19 DNA /MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker最佳條件，對(duì)胃癌C-myc基因的突變情況進(jìn)行檢測(cè)。最佳條件為：篩分介質(zhì)PEO濃度為3.0%，1×TBE作為電泳緩沖液，分離電壓15 kV，溫度15 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 pUC19 DNA /MspⅠ（HpaⅡ）DNA Marker最佳分離條件

CE分離pUC19 DNA /MspⅠ（HpaⅡ）DNA Marker的最佳條件[16]: 3.0% PEO， pH 8.2，電壓15 kV，溫度15 ℃。由圖1可見(jiàn)，所有DNA片段基本得到基線分離，電泳在15 min內(nèi)完成，分離效果好、時(shí)間短。 毛細(xì)管電泳分離pUC19 DNA /MspⅠ（HpaⅡ）DNA Marker結(jié)果見(jiàn)圖1

3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，胃癌與癌旁正常組織擴(kuò)增結(jié)果均可見(jiàn)188 bp單一條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中Maker為100 bp DNA Maker。

3.3 PAGE-SSCP檢測(cè)臨床樣品

將胃癌組織及癌旁正常組織的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后，進(jìn)行PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知，胃癌組織中可得到3種異常遷移帶型:兩條單鏈帶皆發(fā)生遷移、多出或缺少單鏈帶，這些都是異常的單鏈DNA （ssDNA）遷移，由此可判斷產(chǎn)物發(fā)生了堿基改變。樣品1和6分為同一患者癌旁正常組織和癌組織產(chǎn)物變性所得，兩者之間沒(méi)有差異。胃癌組織樣品7、8與其相應(yīng)癌旁正常組織樣品2、3比較存在條帶缺失， 胃癌組織樣品9、10與其相應(yīng)癌旁正常組織樣品4、5比較存在異常遷移條帶。所有樣品中均有未完全變性的雙鏈DNA（dsDNA），以及癌旁正常組織變性得到的ssDNA。

3.4 CE-SSCP檢測(cè)臨床樣品結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)器檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4A為變性胃癌旁正常組織擴(kuò)增樣品， 8.5 min前一條未變性完全dsDNA，8.5～10 min有兩條ssDNA；圖4B，C為變性的具有代表性胃癌組織，除有正常樣品的dsDNA， ssDNA外，還具有異常ssDNA。CE-SSCP結(jié)果與PAGE-SSCP結(jié)果得到一致結(jié)果，但CE檢測(cè)具有更高的靈敏度。

3.5 DNA序列分析結(jié)果

為進(jìn)一步證實(shí)胃癌組織中C-myc基因中的突變點(diǎn)，將胃癌患者癌組織及癌旁正常組織的C-myc進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示C-myc基因第二外顯子第53密碼子存在點(diǎn)突變，堿基由GAT→GTT，最終表現(xiàn)為氨基端由亮氨酸變?yōu)楣劝滨０罚瑥亩鴮?dǎo)致胃癌的發(fā)生。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.6 CE-RFLP檢測(cè)臨床樣品結(jié)果

突變常引起某一區(qū)域酶切位點(diǎn)消失，或產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行酶切，突變基因產(chǎn)生與正常基因長(zhǎng)度不同的片段可用于判斷突變的發(fā)生。C-myc基因由于第53密碼子堿基發(fā)生改變堿基由GAT→GTT，使得內(nèi)切酶EcoRⅤ酶切位點(diǎn)消失.經(jīng)酶切后癌旁正常組織產(chǎn)生83和10[TS（５２] 圖6 CE-RFLP檢測(cè)DNA酶切癌旁正常組織（A）和胃癌組織（B）樣品電泳圖

3.7 C-myc基因突變與臨床病例特性關(guān)系

癌基因C-myc在胃癌中突變率與胃癌分化程度密切相關(guān)。其中低分化腺瘤中突變率為33.3%，中分化腺癌中突變率為18.8%，粘液腺癌中突變率為16.7%，而本實(shí)驗(yàn)中高分化腺癌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變樣本，總突變率為20.0%。大量文獻(xiàn)已報(bào)道，胃癌的發(fā)生與飲食有很大關(guān)系。本研究探討胃癌的發(fā)生和飲酒、吸煙等不良嗜好是否相關(guān)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。只有1例突變患者有吸煙史，2例突變患者有飲酒史。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CE采用PEO作為篩分介質(zhì)的檢測(cè)方法具有分離效率高，分析速度快，樣品和試劑用量少，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，在核酸、蛋白質(zhì)等生物樣品的分析方面發(fā)揮著重要的作用， 并具有巨大的潛力。

C-myc是否是胃癌相關(guān)基因一直有爭(zhēng)議。Tamseki等[17]發(fā)現(xiàn)C-myc表達(dá)在癌和癌旁粘膜中無(wú)區(qū)別， 認(rèn)為C-myc變異與胃癌無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C-myc基因在胃癌組織中突變率為20.0%（10/50）比文獻(xiàn)[18]報(bào)道C-myc在胃原發(fā)癌擴(kuò)增頻率為18.8%略有提高，提示C-myc突變與胃癌有關(guān)。且經(jīng)測(cè)序證實(shí)C-myc基因第二外顯子第53密碼子存在點(diǎn)突變，堿基由GAT→GTT，最終表現(xiàn)為氨基端由亮氨酸變?yōu)楣劝滨０罚砻魑赴┲写嬖贑-myc基因突變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C-myc基因突變率在胃癌低分化腺癌中突變率最高（33.3%），其次為中分化腺癌（18.8%），再次為粘液腺癌（17.6%），而高分化腺癌中沒(méi)有發(fā)生突變。Tsubi等[19]報(bào)告C-myc mRNA表達(dá)在快速生長(zhǎng)和低分化腺癌中明顯增高，在緩慢生長(zhǎng)和高分化腺癌中僅輕度增高，與本研究結(jié)果具有一定的一致性，這足以說(shuō)明原癌基因C-myc突變與胃癌的惡性程度有關(guān)。對(duì)存在基因突變的胃癌患者生活習(xí)慣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)C-myc基因突變與吸煙飲酒等行為無(wú)顯著的相關(guān)性。

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Determination of Mutation of C-myc Oncogene in Gastric Cancer

by Capillary Electrophoresis

XIE Xi-Hui 1， 2， WANG Rong *1， 2， JIA Zheng-Ping*1， 2， XIE Hua1

ZHAMG Ai-Mei3， XU Juan1， WANG Xiao-Li1， WANG Xian-Hua1

1（State Base for Drug Clinical Trails， Lanzhou General Hospital of Chinese People′s Liberation Army， Lanzhou 730050）

2（Pharmacy College， Lanzhou University， Lanzhou 730000）

3（Life Science College， Northwest Normal University， Lanzhou 730070）

Abstract Activation of C-myc oncogene by mutation has been reported to play an important role in gastric cancer tumorigenesis. We determined C-myc mutation in 50 patients with gastric cancer by capillary electrophoresis （CE） to establish an exactly and volant clinical diagnostic method in early gastric cancer. In this experiment， genomic DNA was extracted from normal tissue and gastric cancer tissue and the sequence of C-myc oncogene on exon 2 （possible with high mutation frequency） in the extracted genomic DNA was amplified by polymerase chain reaction （PCR）. Then amplified DNA samples were denatured at 96 oC and digested by EcoRⅤ and detected by PAGE-single strand conformation polymorphism （SSCP）， CE-SSCP， CE-restriction fragment length polymorphism（RFLP）. The optimum CE detection conditions including 3.0% sieving medium poly（ethylene oxide）（PEO）， pH 8.2， separation voltage of 15 kV and temperature of 15 oC were adopted. The laser-induced fluorescence detector was set at λex＝488 nm， λem＝520 nm. The results reveal that the mutation frequency of C-myc gene is 20.0% （10/50）. Sequence analysis further identified a point mutation of A to T in exon 2 codon 53 （GAT→GTT）， causing an amino acid substitution of leucine to glutamine. This study may suggest a correlation of the mutation of C-myc oncogene with gastric cancer progression. This work also demonstrates that CE can offer a convenient and reliable method to early diagnosis of gastric cancer.

Keywords Gastric cancer; C-myc; Mutation; Capillary electrophoresis; Single strand conformation polymorphism; Restriction fragment length polymorphism