基于熒光硅球的克倫特羅快速定量免疫層析試紙條的研制

摘 要 采用熒光硅球為標記物制備了快速定量檢測克倫特羅（CLE）的熒光硅球免疫層析試紙條。通過正交實驗得到最優熒光硅球抗體標記量、硅球墊抗體標記物用量以及檢測線抗原濃度。在最優條件下，試紙條線性范圍為0.28～3.3 。豬尿樣品CLE加標回收率為81.7%～101%，表明此試紙條可實現豬尿中CLE殘留的快速定量檢測。

關鍵詞 熒光硅球； 定量檢測； 克倫特羅； 試紙條

1 引 言

克倫特羅（Clenbuterol，CLE）是一種β-腎上腺素受體激動劑，在畜牧生產中大劑量使用可明顯提高瘦肉率[1]，俗稱為“瘦肉精”。人食用殘留有CLE的肉制品后，對肝、腎等內臟器官會產生毒害作用，嚴重者會引起死亡[2， 3]。因此，各國政府都禁止CLE用作肉用動物的飼料添加劑，我國農業部也明文禁止在飼料中添加CLE，并規定在動物性食品中不得檢出CLE。

目前，分析CLE殘留的常用方法有酶聯免疫吸附法（ELISA）[4]、氣相色譜串聯質譜法（GC-MS）[5]、高效液相色譜法（HPLC）[6]和液相色譜串聯質譜法（LC-MS）[7]等。上述方法具有靈敏、準確、特異等優點。但是，存在檢測方法復雜，費用昂貴等缺點，不適于市場現場監督。膠體金免疫層析試紙條法因操作簡便、檢測快速、費用低等特點，已廣泛用于食品安全現場初篩檢測[8～10]。但以膠體金為標記物的檢測方法靈敏度相對偏低，且只能用于定性或半定量分析。而以量子點、上轉磷光納米粒子及熒光硅球為代表的新型發光標記材料在生物分析中可去除本底干擾，是免疫層析定量檢測的備選標記物。目前，熒光硅球在氯霉素及呋喃唑酮類藥物殘留檢測試紙條中已有應用[11～13]，表現了較高的靈敏度，但仍僅用于定性分析。

本研究以熒光硅球標記抗克倫特羅的單克隆抗體（Anti-CLE mAb）作為指示CLE分子的熒光標記物，制備了一種可用于定量檢測豬尿中CLE的免疫層析試紙條。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

XYZ3000點膜儀（Bio-Dot公司）；透射電鏡（日本JEOL公司）；Zeta電位分析儀（英國馬爾文公司）；試紙條讀取儀（無錫中德伯爾生物技術有限公司）；熒光分光光度計（日本日立公司）；Milli-Q水處理系統、硝酸纖維膜（NC膜）、熒光硅球墊、樣品墊、吸水紙及PVC底板（美國Millipore公司）。

羧基修飾的熒光硅球（羧基密度625 、Anti-CLE mAb以及CLE-BSA（無錫中德伯爾生物技術有限公司）；克倫特羅、萊克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Salbutamol）、塞曼特羅（Cimaterol）、西布特羅（Cimbuterol）、特布他林（Terbutaline）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC#8226;HCl）購自Sigma公司；驢抗鼠二抗（艾美捷科技有限公司）；其它試劑均為分析純（中國醫藥集團上海試劑公司）。

2.2 熒光硅球標記Anti-CLE mAb條件的優化

采用EDC一步法將羧基化熒光硅球與抗克倫特羅的單克隆抗體的氨基偶聯， 在10 mg熒光硅球中加入18 mL 0.01 mol/L pH值為6.0的PB或PBS緩沖液，室溫下分別加入25～175

溶液，然后加入與熒光硅球羧基等同摩爾數的EDC#8226;HCl，室溫攪拌反應2 h后，加入封閉劑1% BSA、0.1% PEG或0.1 mol/L甘氨酸封閉30 min；以8000 r/min離心5 min，棄上清液，以20 mL 0.01 mol/L PB緩沖液洗滌沉淀一次，2 mL PB重懸后，4 ℃保存備用。

2.3 CLE熒光硅球試紙條最佳條件的優化

以熒光硅球抗體標記量、熒光硅球量以及T線CLE-BSA濃度為因素，設計三因素三水平正交實驗優化熒光硅球試紙條檢測性能，具體見表1。通過正交實驗選取陰性樣本顯色正常，陽性樣本IC50（50%競爭抑制率）值最低的條件為試紙條最佳工藝條件。

2.4 熒光硅球試紙條的組裝

采用Bio-Dot XYZ3000點膜儀，將CLE-BSA抗原及驢抗鼠二抗噴涂在NC膜上，分別作為檢測線（T線）與質控線（C線），37 ℃干燥箱干燥過夜；同時將熒光硅球-Anti-CLE mAb偶聯物噴在硅球墊上，30 ℃真空干燥2 h；將NC膜、硅球墊、樣品墊、吸水紙及PVC粘性底板組裝好后，切割成試紙條，加干燥劑于4～30 ℃密封保存。

反應15 min后，送入試紙條讀取儀檢測。檢測過程大致如下：試紙條由傳送裝置送入讀取儀，移動過程C線先經過光學原件，其熒光信號經光電池捕獲后轉換成電信號，產生讀取儀顯示器上第一個熒光峰（信號強度用振幅表示）即C線熒光峰，然后T線經過光學原件產生第二個熒光峰即T線熒光峰，如圖1所示。

3 結果與討論

3.1 熒光硅球理化參數及透射電鏡圖譜

采用有機硅源水解摻雜Ru（4，7-Ph2-phen）3染料合成熒光硅球，最大激發波長450 nm，最大發射波長570 nm。偶聯抗體后

最大發射波長沒有變化，表明偶聯抗體后不會影響其原有的光學性質，但偶聯抗體后其熒光強度有所降低，具體結果見圖2。Zeta電位儀檢測，其Zeta電位為－25.34 mV，表明該熒光硅球表面具有較多負電荷，可保持其在水溶液中的單分散性；透射電鏡結果見圖3，從中隨機挑選40個熒光硅球，分別量取其水平和垂直方向的長度，計算平均粒徑。得到熒光硅球直徑為（77±6）nm，相對標準偏差（RSD）為7.8%，表明熒光硅球大小較均勻，形狀較規則，可應用于免疫層析試紙條的研究。

3.2 熒光硅球標記Anti-CLE mAb最大標記量

將不同抗體標記量的熒光硅球組裝試紙條，檢測在陰性條件下T線信號強度。每個抗體標記濃度檢測5次，繪制抗體標記量與T線振幅曲線，獲得熒光硅球的抗體最大飽和標記量，具體結果見圖4。當抗體標記濃度達到120 mg/g時，T線振幅強度為（62.00±2.16） mV，且隨著抗體標記濃度增大，試紙條T線振幅強度基本趨于穩定，表明1 mg熒光硅球表面最

正交優化的結果如表2所示。當熒光硅球抗體標記量為30 mg/g，硅球墊上熒光硅球噴涂量為10

3.4 標記過程封閉條件對試紙條穩定性的影響

熒光硅球標記抗體后，仍殘留大量羧基，如果不能有效封閉，易在T線產生非特異性吸附，造成假陰性結果。不同封閉劑是影響熒光硅球標記物在微球墊上釋放性的關鍵因素。本研究對比了1% BSA， 0.1% PEG和0.1 mol/L甘氨酸等封閉劑以及封閉時的鹽離子強度對熒光硅球標記物釋放效果的影響。實驗表明，以PBS為封閉溶液，0.1% PEG和0.1 mol/L甘氨酸為封閉劑時，熒光硅球釋放性差， 在NC膜前端有明顯熒光硅球殘留，即存在波浪狀熒光亮線（圖5a），而以含1% BSA的PB緩沖液為封閉條件的熒光硅球，在NC膜前端無殘留（圖5b）。

3.5 檢測時間

免疫層析試紙條是基于抗原抗體免疫學反應的一種快速檢測方法。因此，T線信號強度會隨反應時間延長而逐漸增強直至趨于穩定。本研究以陰性和陽性（CLE添加濃度為1 mg/L）尿樣為測試液，觀測信號強度隨時間的變化趨勢，結果見圖6。從圖6可知，隨著免疫反應時間的延長，無論陰性還是陽性尿樣，T線振幅強度都在增強，15 min后基本趨于穩定。故選擇15 min為定量檢測時間。

3.6 CLE的標準曲線的繪制

熒光硅球試紙條檢測系列加標濃度豬尿，每個濃度檢測6次，繪制標準曲線，如圖7a所示，該標準曲線線性回歸方程為y＝－11.74lnx＋14.29，回歸系數R2＝0.9958，定量檢測范圍為0.28～3.3 mg/L，IC50為0.9 mg/L，表明該抗體對半抗原具有較好的親和性。圖7b為紫外光下熒光硅球試紙條實物圖。可以看出，隨著尿樣中CLE濃度降低，T線顯色逐漸增強，符合免疫學競爭反應規律。

3.7 熒光硅球試紙條的重現性和特異性

采用不同批次的熒光硅球試紙條對陰性豬尿和陰性加標豬尿進行檢測，每個樣品重復檢測5次，批內和批間的RSD分別為6.9%～10.9%和6.8%～9.7%。

試紙條與其它CLE結構類似物交叉反應率（CRR）采用公式（1）[14]計算，具體結果見表3。

CRR（%）＝IC50（CLE）IC50（交叉物）×100（1）

結果表明，該熒光硅球試紙條與其它常見β類興奮劑如萊克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特羅、西布特羅、特布他林交叉反應低，特異性良好。

3.8 CLE在豬尿中的添加回收實驗

在陰性豬尿樣中添加不同濃度的CLE，檢測回收率，具體結果見表4。試紙條檢測3個CLE濃度回收率均在81.7%～101%之間，RSD＜9%，可實現豬尿中CLE現場快速定量檢測。

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A Fluorescent Silica Nanobead-Based Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Clenbuterol

LI Huai-Ming1，2， LAI Wei-Hua1， XU Heng-Yi1， XU Bo3， LUO Wei1，2，

WEI Hua1，2， WANG Shui-Xing2， XIONG Yong-Hua*1，2

1（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047）

2（Sino-German Joint Research Institute， Nanchang University， Nanchang 330047）

3（Wuxi Zodolabs Biotech Co. Ltd， Wuxi 214174）



Abstract A fluorescent silica nanobead-based immunochromatographic test strip was developed for the rapid and quantitative detection of clenbuterol （CLE）. An orthogonal L9（3）3 test was designed， various parameters including amount of anti-CLE monoclonal antibody （mAb） used for nanobeads labeling， mAb labeled beads on conjugate pad， and antigen amount on test line were investigated and optimized. Under the optimal conditions， the linear range was from 0.28 to 3.3