金納米顆粒作為Cu2+氧化半胱氨酸的可視化指示劑及其應用

摘 要 Cu2＋能選擇性氧化半胱氨酸，破壞半胱氨酸與金納米顆粒之間金硫鍵的形成，阻止半胱氨酸導致的金納米顆粒聚集。因而，金納米顆?？勺鳛镃u2＋氧化半胱氨酸的可視化指示劑，本實驗據此建立了高選擇性檢測Cu2＋的色度分析方法。在HClNaAc緩沖體系（pH 3.6）中，金納米顆粒在525 nm處的吸光度值與Cu2＋的濃度在8.0×10－8～2.0×10－6 mol/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9962; 檢出限 （3σ/k） 為1.5×10－9 mol/L。將本方法用于天然水體中Cu2＋的測定，具有較好的精密度和準確度。

關鍵詞 金納米顆粒；Cu2＋；比色檢測；半胱氨酸

1 引 言

Cu2＋是人體必須的微量元素之一，在人體內保持著一種特殊的內穩態。Cu2＋缺乏時，會引起關節炎、血管損傷、冠心病及Menkes等疾?。欢鳦u2＋過量時，則會誘發胃腸炎、癌癥、肝硬化、Wilson病[1]。目前，測定Cu2＋的方法主要有電化學分析法[2～4]、熒光分析法[5～7]、原子吸收光譜法［8，9］、光散射法[10]等。上述分析方法操作繁瑣[4，5]，熒光試劑易漂白[6]，有機小分子的合成較為耗時[10]。胡明明等合成了一種羅丹明B衍生物用作Cu2＋的探針， 實現環境水樣中Cu的可視化檢測［11］。隨著納米分析技術的發展，已經建立了一系列基于金屬納米顆粒特征光譜性質的Cu2＋分析法。如利用半胱氨酸功能化負電金納米顆粒，在Cu2＋存在下，因半胱氨酸的羧基和氨基與Cu2＋形成2∶1絡合物，誘導金納米顆粒聚集，據此檢測10－5 mol/L Cu2＋和半胱氨酸[3，12，13]（圖1a）。在這個作用過程中，金納米顆粒首先需要半胱氨酸巰基功能化，然后再利用Cu2＋與半胱氨酸的羧基和氨基發生配位作用。Cu2＋的分析是二步法，較為復雜。在這個過程中，Cu2＋也可與半胱氨酸上沒有與金納米顆粒作用的[TS（] 圖1 金納米顆粒檢測Cu2＋示意圖

Fig．1 Schematic illustration of colorimetric determination of Cu2＋based on gold nanopanticles （AuNPs）[TS）]游離巰基發生氧化還原作用[14，15]。

與文獻的兩步法不同的是，本實驗采用如圖1b所示的一步法，即以半胱氨酸和金納米顆?；旌弦簽閰⒖急尘?，充分利用Cu2＋與半胱氨酸巰基之間的氧化還原作用，以表面等離子體共振吸收作為測定參數檢測水環境中Cu2＋。本方法簡單，靈敏度高，選擇性好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV3600 紫外可見分光光度計、F4500熒光分光光度計、S4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；pHS3C 型酸度計（成都方舟科技開發公司）；QL901漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HH2數顯恒溫水浴鍋（江西省榮華儀器制造有限公司）；ZetasizerNanoZS（馬爾文儀器有限公司）。

2.0 mmol/L 氯金酸溶液（HAuCl4， 國藥集團化學試劑有限公司）; 0.01 mol/L NaBH4，0.20 mol/L十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB），均購自國藥集團化學試劑有限公司；0.10 mol/L抗壞血酸（LAA，重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠）; 1.0×10－5 mol/L CuCl2（天津市河北區海晶精細化工廠），1.0×10－4 mol/L 半胱氨酸（LCys，成都市科龍化學試劑廠）置于4℃冰箱避光保存，使用 pH 3.6鹽酸醋酸鈉（HClNaAc）緩沖液控制酸度。實驗用水均為超純水，試劑均為分析純。

2.2 金納米粒子的制備

采用晶種生長法[16]制備金納米顆粒，用6.0×10－3 mol/L新制的冰凍NaBH4溶液在7.5×10－2 mol/L CTMAB溶液中還原2.5×10－4 mol/L HAuCl4溶液，劇烈混勻約30 s后，置于29 ℃恒溫水浴鍋中靜置2 h。在含有1.0 mL 2.0×10－3 mol/L HAuCl4和7.1 mL H2O 的生長液中加入0.80 mL 1.6×10－3 mol/L CTMAB，溶液迅速由淺黃色變成橙色，加入0.6 mL 6.0 mmol/L LAA，搖勻，溶液立即變為無色。加入0.5 mL上述已靜置2 h的金種，搖勻，溶液顏色逐漸變紅。將溶液放置于29 ℃恒溫水浴鍋中靜置24 h，形成粒徑約為25 nm的金納米顆粒。金納米顆粒的濃度為2.0×10－4 mol/L（按照金原子的濃度來計算）。

2.3 實驗方法

在1.5 mL EP管中加入適量1.0×10－5 mol/L CuCl2溶液，0.10 mL 1.0×10－4 mol/L LCys溶液，在50 ℃水浴中反應 5 min，加入0.075 mL HClNaAc緩沖溶液（pH 3.6），用二次蒸餾水定容至0.45 mL，再加入0.30 mL 2.0×10－4 mol/L金納米顆粒，每加入一種溶液后均搖勻；在50 ℃水浴中反應15 min。在UV3600紫外可見分光光度計上掃描測得吸收光譜，波長范圍為400～800 nm。

3 結果與討論

3.1 光譜特征

粒徑為25 nm 單獨金納米顆粒（AuNPs）在525 nm處有一特征等離子體共振吸收峰（圖2a），當加入LCys后，AuNPs和LCys之間形成AuS，LCys的羧基和氨基通過氫鍵作用，誘導AuNPs發生聚集[17～19]，表現為在700 nm處有一新峰出現，而525 nm處的吸收峰強度降低。但在有Cu2＋存在的介質中，700 nm處的吸收峰強度隨Cu2＋濃度的增大而逐漸降低，直至消失。而525 nm 吸收峰強度逐漸增強，且與Cu2＋濃度呈良好的線性關系。其原因是Cu2＋與LCys之間先發生了氧化還原作用，使得LCys的巰基不再與AuNPs作用形成AuS，導致越來越多的AuNPs處于分散狀態。

從體系的散射光譜（圖2b）可知，單獨的AuNPs和AuNPsCu2＋ 溶液中納米顆粒都比較分散，等離子體共振散射強度相對較弱，而AuNPsCys溶液中納米顆粒呈聚集狀態，等離子體共振散射強度明顯增強。但在有Cu2＋存在的介質中，等離子體共振散射強度隨著加入的Cu2＋濃度的增大逐漸降低，這與吸收光譜的結果是一致的，其原因是AuNPs由聚集變得越來越分散。該結果還可以進一步從掃描電子顯微鏡（SEM）圖得到證實。如圖3所示，在pH 3.6時， LCys形成兩性離子[17，20]，誘導AuNPs聚集（圖3a）；但當LCys溶液先與一定量的Cu2＋反應一段時間后，再加AuNPs，則AuNPs較分散，僅有少量AuNPs團聚在一起（圖3b），實驗結果與吸收和散射圖譜得出的。[TS（]圖2 Cu2＋存在下，AuNPs與Cys 作用的等離子體共振吸收光譜（a）和等離子體共振散射光譜（b）

Fig．2 Plasmon resonance absorption spectra （a） and plasmon resonance light scattering （PRLS） spectra （b） of reaction between AuNPs and Cys in the absence/presence of Cu2＋

1. AuNPsCys; 2～4. AuNPsCysCu2＋; 5. AuNPsCu2＋; 6. AuNPs. 9.3×10－5 mol/L AuNPs; 1.5×10－5 mol/L Cys; Cu2＋ （Curves 2～5，

其原因是強還原劑LCys將弱氧化劑Cu2＋還原成Cu＋，自身被氧化變成了胱氨酸，Cu＋與多余的LCys形成穩定的絡合物[14，15]。半胱氨酸的巰基與AuNPs之間的AuS減少，導致AuNPs的聚集程度減弱; 隨著Cu2＋量的增加，AuNPs變得越來越分散。為了進一步證實此作用機理，采用動態光散射實驗測定Cu2＋和半胱氨酸作用前后金納米顆粒水和粒徑的變化（圖4）。結果表明，隨著Cu2＋濃度增大，AuNPs聚集體顆粒平均粒徑逐漸減小。

3.2 反應條件的優化

圖5為LCys用量對體系吸收強度的影響。當LCys濃度較小時，Cu2＋不能很好地阻止AuNPs聚集；而LCys濃度太大時，則需要較多的Cu2＋與其反應，影響Cu2＋的檢測靈敏度；1.5×10－5 mol/L LCys可以使AuNPs完全聚集，Cu2＋檢測的靈敏度較高。本實驗中LCys用量選擇1.5×10－5 mol/L。

LCys通過AuS結合在金膠表面。在pH≈4.0時，形成兩性離子，并通過靜電作用誘導AuNPs發生聚集[17，20]。實驗表明，當溶液pH＞4.8或pH＜3.0時，Cu2＋與LCys的作用不強，阻止AuNPs發生聚集的能力較弱；當pH＝3.6時，Cu2＋阻止AuNPs聚集的能力最強。故實驗選擇pH 3.6。

實驗表明，LCys與AuNPs作用的吸收強度隨著時間的延長而降低，15 min后基本保持不變，此時反應基本達到穩定。而加入Cu2＋溶液后，吸收強度隨時間無明顯變化，故將反應時間固定為15 min。

隨著溫度的升高，巰基活性增強，加劇了AuNPs的聚集程度；但溫度過高巰基易被空氣中的氧氧化，不利于AuS的形成，導致AuNPs聚集程度降低。同時，隨著溫度的升高，Cu2＋與LCys作用能力增強，但不能完全破壞AuS形成。在50 ℃時，空白與樣品的吸收值相差最大，說明該溫度下，Cu2＋阻止AuNPs聚集的能力最強，故反應溫度選擇50 ℃。

3.3 方法的選擇性

如圖6所示，在該實驗條件下，共存濃度為1.3×10－6 mol/L的常見13種金屬離子（Zn2＋， Mg2＋， Cd2＋， Co2＋， Al3＋， Ca2＋， Pb2＋， Fe3＋， Fe2＋， Ni2＋， Mn2＋， Li＋和Hg2＋）對Cu2＋測定基本無干擾。其中包括與巰基結合力較強的Hg2＋，這可能是由于巰基與AuNPs的作用力強于Hg2＋。

3.4 標準曲線和樣品分析

實驗表明，金納米顆粒在525 nm處的吸光值強度與Cu2＋的濃度在8.0×10－8 ～2.0×10－6 mol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為A＝0.125＋0.0508C，相關系數為0.9962; 檢出限為（3σ/k） 為1.5×10－9 mol/L。將本方法用于合成樣品中Cu2＋的測定，結果如表1所示。Cu2＋的回收率為95.0%～99.1%，RSD＜0.78%。為了驗證方法的實用性，測定了來自嘉陵江、西南大學崇德湖和自來水等實際樣品中銅的含量。將江水和湖水過濾，自來水煮沸后冷卻過濾。采用標準加入法進行回收實驗，測定結果如表2所示，回收率為92.8%～105.4%; RSD＜1.69%。說明本方法具有較好的精密度和準確度。

本實驗利用Cu2＋和半胱氨酸的相互作用，阻止半胱氨酸誘導金納米顆粒聚集引起的表面等離子體共振吸收變化，建立了一種檢測水環境中Cu2＋高靈敏度和高選擇性比色分析方法。金納米顆粒是一種很好的Cu2＋氧化半胱氨酸的可視化指示劑。本方法簡單、可操作性強、靈敏度高。

References

1 JIANG YuanRu （江元汝）. Life ChemistryTrace Elements and Health（生活中的化學微量元素與健康）. Beijing（北京） : China Building Materials Industry Press （中國建材工業出版社）， 2004: 77～85

2 Jena B K， Raj C R. Anal. Chem.， 2008， 80（13）: 4836～4844

3 Cui X， Fu Y Z， Li M S， Chen M， He X， Liu X H， Feng X M. Sci. Shina Chem.， 2010， 53（1）: 257～262

4 Gooding J J， Shein J ， Lai L M H. Electrochem. Commun.， 2009， 11（10）: 2015～2018

5 Chen W B， Tu X J， Guo X Q. Chem. Commun.， 2009， （13）: 1736～1738

6 Goswami S， Chakrabarty R. Tetrahedron. Lett.， 2009， 50（43）: 5910～5913

7 WU LinHua， HAN LiFeng， RUAN YiBin， JIANG YunBao （吳粦華，韓莉峰，阮藝斌，江云寶）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（1）: 121～124

8 ZHANG Yuan， LIN ZheXun， LI WeiQiu， ZHANG QiaoXin， LI Hui， LUO HongJun， LUO WenHong(張 源， 林哲絢， 李偉秋， 張俏忻， 李 慧， 羅紅軍， 羅文鴻). Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學與光譜分析)， 2009， 29(10): 2864～2866

9 WEN XiaoDong， WU Peng， HE YiHua， XU KaiLai， L Yi， HOU XianDeng(溫曉東， 吳 鵬， 何藝樺， 徐開來， 呂 弋， 侯賢燈). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學)， 2009， 37(5): 772～775

10 Long Y F， Huang C Z， He R X， Li Y F. Anal. Chim. Acta， 2008， 624（1）: 128～132

11 HU MingMing， FAN JiangLi， LI HongLin， PA HaDing， ZE YaoDong， PENG XiaoJun(胡明明， 樊江莉， 李宏林， 帕哈丁， 澤耀東， 彭孝軍). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學)， 2011， 39(8): 1195～1200

12 Yang W R， Gooding J J ， He Z C， Li Q， Chen G N. J. Nanosci. Nanotechno.， 2007， 7（2）: 712～716

13 Li L， Li B X. Analyst， 2009， 134（7）: 1361～1365

14 Prudent M， Girault H H. Metallomics.， 2009， 1（2）: 157～165

15 Patterson R A， Lamb D J， Leake D S. Atherosclerosis.， 2003， 169（1）: 87～94

16 Sau T K， Murphy C J. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（28）: 8648～8649

17 Sudeep P K， Joseph S T S， Thomas K G. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（18）: 6516 ～6517

18 Wang J， Li Y F， Huang C Z， Wu T. Anal. Chim. Acta， 2008， 626（1）: 37～43

19 Hu X G， Cheng W L， Wang T， Wang E K， Dong S J. Nanotechnolog.， 2005， 16（10）: 2164～2169

20 Kou X S， Zhang S Z， Yang Z， Tsung C K， Stucky G D， Sun L D， Wang J F， Yan C H. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（20）: 6402～6404

Gold Nanoparticles as a Visual Indicator for Redox Reaction Between

Copper Ion and Cysteine and Its Analytical Application

TANG Jie， WANG Jian， WANG Yi， LI YuanFang*

（Education Ministry Key Laboratory on Luminesence and RealTime Analysis，

College of Chemistry and Chemical Engineering， Southwest University， Chongqing 400715）



Abstract A colorimetric method for copper ion （Cu2＋） in aqueous solution is described on the basis of the oxidation of thiol group of cysteine by Cu2＋， which depends on the binding of cysteineAuNPs and with the damage of binding， the formation of gold nanoparticle aggregates would be restrained. Thereby AuNPs acts as the visualization indicator for the oxidation of cysteine by copper ions. In a medium of pH 3.6， a linear relationship has been obtained between the absorbance at 525 nm and the concentration of Cu2＋ in the range of 8.0×10－8－2.0×10－6 mol/L with the correlation coefficient （r） of 0.9962 and the detection limit （3σ/k） of 1.5×10－9 mol/L. The proposed method has been successfully applied to the analysis of synthetic mixtures and water samples.

Keywords Colorimetric detection; Copper ions; Gold nanoparticles; Lcysteine