副溶血性弧菌細胞猝滅及代謝物組提取方法的優化

摘 要 以氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）為分析方法，比較了液氮和75%甲醇（－80 ℃）兩種溶液對副溶血性弧菌細胞的猝滅效果，以及氯仿、75%冰甲醇、水、甲醇-氯仿-水（10∶3∶1， V/V）、甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）、甲醇-氯仿（1∶1， V/V）6種提取劑對副溶血性弧菌代謝物組的提取效果。結果表明，用75%甲醇（－80 ℃）猝滅副溶血性弧菌時，出現了代謝物泄漏現象，而液氮猝滅則不存在這個現象；檢索發現，采用75%冰甲醇提取獲得了47種代謝物，峰面積標準偏差為8.02%，其它5種提取劑獲得代謝物種類少于40種，且重現性差。比較色譜峰數量、面積和重現性后發現，液氮猝滅、75%冰甲醇提取適于副溶血性弧菌代謝物組提取。

關鍵詞 副溶血性弧菌； 猝滅方法； 代謝物組提取方法； 氣相色譜-質譜聯用

1 引 言

代謝組學通過定性與定量研究生物體內代謝物的變化研究生物體代謝途徑，代謝組學主要關注分子量小于1000的小分子[1]。目前，代謝組學的研究已在藥物研發[2]、代謝成分研究、疾病檢測[3～5]、生物標志物尋找[6]等方面展開。近幾年代謝組學在微生物研究中迅速展開，已對部分微生物代謝物提取方法進行了優化[7～9]，并研究了猝滅過程中的冷休克現象[10]。

副溶血性弧菌是一種常見的食源性致病菌，由該菌引起的食物中毒事件占細菌性食物中毒事件60%以上[11]。代謝組水平研究是副溶血性弧菌的致病機理的重要研究內容。本研究對副溶血性弧菌細胞猝滅及代謝物組提取方法進行了優化，為副溶血性弧菌代謝組學分析奠定了基礎。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

5975B型質譜、6890N型氣相色譜（美國Agilent公司）； JY92-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Hermle Z36HK冷凍離心機（德國Hermle公司）；真空干燥機（美國Eppendorf公司）；1

2.4 數據分析與統計檢驗

本研究采用NIST、Origin 8.0、Past 1.79和SPSS 13.0對實驗結果進行分析，根據不同方法得到的色譜總離子圖中峰數量和峰面積判斷不同方法的優劣。匹配度為樣品質譜圖與標準圖譜的正檢索相似系數（0～1000），匹配度≥700為適合匹配度。可能性為樣品質譜圖與標準圖譜的正、反檢索相似系數的綜合，置信區間為≥80%。

3 結果與討論

3.1 細胞猝滅方法比較

比較75%甲醇（－80 ℃）與液氮兩種溶劑對副溶血性弧菌細胞的猝滅效果。用75%甲醇（－80 ℃）和液氮分別處理同一批樣品，用6種溶劑對代謝物進行提取。由較圖1和表1可見，用液氮猝滅后，以75%冰甲醇提取，獲得峰數量最多。75%甲醇（－80 ℃）猝滅時，細胞出現代謝物泄漏（圖2和表2）。液氮猝滅速度快，不存在代謝物泄漏問題，且操作簡便，因此，液氮更適合于副溶血性弧菌猝滅。

3.2 代謝物組提取方法比較

由圖1可見，以75%冰甲醇為提取劑時，獲得的代謝物種類最多；以甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）為提取劑時，所提取代謝物量最多，但重現性較差。計算6種提取溶劑3個平行中峰面積的相對標準偏差，結果顯示，75%冰甲醇、氯仿、水、甲醇-氯仿-水（10∶3∶1， V/V）、甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）和甲醇-氯仿（1∶1， V/V）的標準偏差依次為 8.02%， 4.79%， 27.00%， 71.33%， 13.10%和9.93%。6種提取溶劑的提取結果經主成分分析（PCA）及聚類分析（CA）發現，甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）提取所得代謝物種類與前5種差異較大（圖3）。對75%冰甲醇提取所得總離子圖分析，根據峰面積、峰數量、相對標準偏差及物種數量，確定75%冰甲醇最適合于副溶血性弧菌代謝物組的提取（表3）。

3.3 方法穩定性測定

樣品經液氮猝滅、75%冰甲醇提取，衍生化后，進行GC-MS分析，比較所得圖譜的峰數量及峰面積。結果顯示，所有共有峰保留時間重現性良好，幾乎所有峰面積相對標準偏差均小于5%，總峰面積相對標準偏差為5.56%，說明此方法的穩定性較好（圖4）。

3.4 放置時間對提取代謝物組的影響

樣品經液氮猝滅、75%冰甲醇提取的代謝物組衍生化后，在－20 ℃放置48 h。對放置前后樣品進行分析。結果發現，峰數量未發生變化，單個峰面積相對標準偏差小于5%，總峰面積相對標準偏差為7.84%。結果表明，放置前后樣品未發生明顯變化。

4 結 論

以GC-MS為代謝組分析方法，對副溶血性弧菌細胞猝滅及代謝物組提取方法進行優化。用NIST質譜數據庫快速檢索代謝物，發現75%甲醇（－80 ℃）猝滅過程中磷酸、棕櫚酸和丙三醇等出現泄漏。比較6種提取劑提取所得總離子圖發現，75%冰甲醇獲得峰數量最多，重現性較好。液氮猝滅，75%冰甲醇提取，適用于副溶血性弧菌代謝物組，為副溶血性弧菌代謝組學分析奠定了良好基礎。

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Comparison of Quenching and Extraction Methods for Metabolome

Analysis of Vibrio Parahaemolyticus

ZHAO Qiang， LIU Hai-Quan， LU Ying， SUN Xiao-Hong， PAN Ying-Jie， ZHAO Yong*

（Shanghai Ocean University， College of Food Science ＆Technology， Shanghai 201306）

Abstract A reliable cell quenching and metabolite extraction method was crucial for microbial metabolism analysis. For metabolism analysis of Vibrio parahaemolyticus， liquid nitrogen and 75% methanol （－80 ℃） were compared for their efficiency of cell quenching， and six different extraction solvents based on （i） chloroform， （ii） 75% cold methanol， （iii） water， （iv） methanol:chloroform:water＝10∶3∶1 （V/V）， （v） methanol:chloroform:water＝3∶1∶1 （V/V） and （vi） methanol∶chloroform＝1∶1 （V/V） were compared for their efficiency of metabolites extracting. The metabolites were detected by GC-MS. The results showed that leakage of metabolite occurred when quenched with 75% methanol （－80 ℃）; however this phenomenon did not occur with liquid nitrogen. 47 metabolites were found when extracted with 75% cold methanol， and the relative standard deviation of peak area was 8.0%. In contrast， 40 or less metabolites were detected with other extraction methods， and the reproducibilities of those methods were unsatisfactory. For global analysis， quenching with liquid nitrogen and extraction with 75% cold methanol was very suitable for metabolomics studies of Vibrio parahaemolyticus.

Keywords Vibrio parahaemolyticus; Method for quenching; Method for metabolites extraction; Gas chromatography-mass spectrometry