食管癌微衛星不穩定的研究進展

霍亞蘭綜述 劉風玲審校

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發生與諸多因素有關。近年來隨著分子生物學的發展，越來越多研究發現，細胞惡性轉化與其遺傳物質(即基因組)的不穩定性有關，在分子遺傳學方面主要表現為微衛星不穩定(micro--satellite instabitity，MSI)，而食管癌是1種具有遺傳傾向的疾病，微衛星不穩定與其發生、發展及預后都有關，是目前研究的熱點。現就食管癌MSI的研究作一綜述。

1 微衛星與微衛星不穩定

微衛星(MS)為短的基因片段或由核苷酸串聯而成的重復序列，也稱作短小串聯重復序列(STRs)，廣泛分布于人類基因組中，由1～6個核苷酸組成，常見的有2、3、4核苷酸重復序列，最常見的是二核苷酸重復序列(CA/GT)n。(CA/GT)n中n為重復次數，通常為15～60次，重復單位結構相同。MS一般處于DNA編碼區域附近，也可以位于內含子或啟動子中，在人群中表現為遺傳穩定性、高度個體特異性及高度多態性。

MS在腫瘤基因調控中發揮著重要作用。從基因水平上，細胞發生惡變常伴有原癌基因或抑癌基因的突變、擴增、重排或丟失，MS通過改變DNA結構或通過與特異性蛋白結合調控基因重組而發揮作用。腫瘤分子遺傳學研究表明，1個正常細胞惡性轉化需要多個遺傳改變的積累，一類是癌基因與抑癌基因的改變，另一類就是發生MSI。

MSI是指在各種致瘤因素作用下，細胞中某一MS由于DNA復制錯誤(replication error，RER)引起的重復序列的改變。它的產生機制是DNA在復制或修復過程中，DNA滑動或滑動鏈與互補鏈的堿基錯配或有絲分裂、減數分裂期染色體不對等交換，導致重復單位的插入與缺失，造成等位基因的結構、大小發生改變，進而DNA基因序列發生改變。MS序列的改變使MS不能正常發揮調控作用，引起細胞增殖、分化均發生異常，導致腫瘤的發生。MSI包括核微衛星不穩定性(nuclearmicrosatellite instabitity，nMSI)和線粒體微衛星不穩定性(mitochondrialmicrosatellite instability，mtMSI)。MSI僅在腫瘤細胞中表達，廣泛存在于大腸癌、胃癌、子宮內膜癌等［1，2］中，在食管癌中也有表達，在腫瘤基因調控中起著重要作用，參與腫瘤的發生與發展。

人類的基因組存在基因錯配修復系統(mismatch repair system MMR)，是人體細胞修復DNA堿基錯配的安全保障體系，大部分發生錯配的基因因此可恢復正常，從而保持遺傳物質的完整性和穩定性。目前所知的人類錯配修復系統中含有6個錯配修復基因，分別為 hMSH2、hMSH3、hMSH6/hGTBP、hMLH1、hMLH3、hPMS1［3］。該基因家族中任一基因突變，都會使細胞錯配修復功能缺陷，錯配修復蛋白功能失活，基因堿基錯配率升高。錯配的堿基如果發生于MS位點，就會造成MSI，誘發癌基因激活或者抑癌基因失活，產生遺傳不穩定性，導致腫瘤易感。在MMR存在缺陷的細胞中，編碼區域的MS序列發生插入或缺失幾個核酸堿基被認為是MS腫瘤形成的重要分子機制［4］。核酸堿基的插入或缺失使多個包括控制細胞增殖和存活的基因突變，使細胞向惡性轉變。位于編碼區的靶基因如生長因子受體基因TBGβRⅡ和IGFⅡR、BAX等發生MS突變，多表現為基因雜合性丟失、基因表達能力缺失或下降、蛋白產物活性降低或喪失。由此，有學者提出通過新的基因靶點的確認有助于闡明MMR缺陷腫瘤演變路徑，為腫瘤的治療提供思路［5］。

美國國立癌癥研究所(NCI)推薦5個MS位點，即BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250。在腫瘤的檢測中，陽性位點≥40%(即推薦的5個位點中有2個及以上發生突變)為高度MSI(MSI-H)，陽性位點＜40%(即推薦的5個位點中只有1個發生突變)為低度MSI(MSI-L)，無陽性位點為微衛星穩定(misrosatellite stability，MSS)［6］。目前進行的研究大多數是對MSI位點進行檢測研究，進而指導臨床。MSI位點檢測可作為臨床篩查惡性腫瘤高危人群的分子手段，在腫瘤的診斷和遺傳性腫瘤的預防中有重要意義。

2 食管癌中MSI的研究

2.1 食管癌的病理類型與MSI

食管癌的病理類型有鱗狀細胞癌、腺癌及小細胞癌等。不同病理類型的食管癌MSI的發生率也不同。有研究［7］表明MSI主要發生于食管小細胞癌和鱗狀細胞癌中，小細胞癌中MSI的檢出率為100%，鱗狀細胞癌MSI的檢出率為13.8% ～64.0%，提示MSI是食管鱗狀細胞癌發生過程中的早期分子事件。Cai等［8］發現MSI是食管鱗狀細胞癌的重要相關因素，但與臨床病理特征無顯著性差異。趙雍凡等［9］檢測的57例食管鱗狀細胞癌中 23例發生 MSI(40.3%)，3例小細胞癌均發生 MSI(100%)。翟瑜等［10］檢測了23例食管鱗狀細胞癌，6例發生MSI(26.1%)，5例小細胞癌均檢出MSI(100%)。由此更加證實，食管小細胞癌中更易檢出MSI，而鱗癌的MSI檢出率也較高。

2.2 MSI與食管癌臨床特征之間的關系

有報道［11］指出MSI與腫瘤的分期及預后關系不大。吳顏暉等［12］研究發現食管癌中微衛星不穩定性、10q23微衛星標記的雜合性缺失及總等位基因不平衡與患者的TNM分期及淋巴結轉移之間無顯著相關性。YAN KUN等［13］在檢測MSDNA不穩定時發現MSI與食管癌的臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移之間無顯著性差異，研究結果基本一致。

2.3 MSI與幽門螺旋桿菌感染的關系

消化道腫瘤與幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的關系一直是近年來研究的熱點，食管癌中Hp感染也越來越受到關注。很多研究發現Hp感染與食管癌，尤其是與食管鱗癌的發生有密切關系。陳健等［14］研究顯示正常人食管Hp的感染率為21.25%(17/80)，食管癌患者的感染率為92.5%(74/80)。Ye等［15］及 Wang等［16］研究均認為，Hp 感染與食管鱗癌的發病率呈正相關。Hp的慢性感染很可能是食管癌發生的起始因素，Hp感染、種植，刺激機體產生亞硝胺，破壞食管黏膜，使其暴露于高酸環境的可能性增加，引起慢性炎癥，進而誘發食管癌。Hp感染還可能參與食管癌發生過程中的血管形成。

在Hp感染與MSI之間是否存在相關性的研究比較少。吳禮高等［17］研究提示食管癌組織中的Hp感染尤其Hp-L型感染是常見現象，與食管鱗狀細胞癌的發生密切相關。該研究指出，在Hp感染引發炎癥時，產生大量氧自由基，引起mtDNA損傷;加上可能存在DNA聚合酶r的修復功能缺陷，最終導致mtMSI。由此推測，Hp感染可能通過氧化損傷食管黏膜，引發mtMSI而致腫瘤發生。

2.4 食管癌MSI與地域的關系

食管癌中MSI的地域性差異似乎不很明顯。李小東等［18］對中國南方(潮汕地區)食管鱗癌的研究發現，食管鱗癌患者D5S107和D5S408的雜合性丟失率分別為48.5%和34.3%，推測MSI在中國南方食管癌發生過程中可能不占主導地位。中國北方人群錯配修復基因突變譜廣泛，突變類型多樣［19］，目前食管癌MSI的相關資料和信息尚不足，需要進一步進行研究、驗證。

2.5 食管癌中COX-2與MSI的關系

環氧化酶(COX)是生物合成前列腺素的限速酶，COX-2是其1個亞型，在大多數組織中表達極少或幾乎無表達，但在腫瘤組織中表達顯著增加。COX-2調節腫瘤的發展和凋亡，與腫瘤的發生有密切關系，是目前研究的熱點之一。多項研究表明，COX-2在食管癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中均呈高表達。

COX-2在食管癌的發生、發展中的作用機制尚未完全闡明，可能與以下因素有關:①食管癌中COX-2的表達與腫瘤微血管密度、VEGF表達呈正相關［20］，還可促進腫瘤血管形成;②COX-2過度表達可以促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡。有研究證明，COX-2活性增高會提高凋亡抑制基因bcl-2的表達水平及降低促凋亡蛋白Bax的表達水平［21］;③增加腫瘤細胞的侵襲力;④免疫抑制作用。此外，對生物膜和線粒體的氧化損傷也是誘發腫瘤的重要原因。

對于腫瘤中MSI與COX-2的關聯，很多研究表明，在MSI腫瘤中，如胃癌［22］、結直腸癌［23］中 COX-2 的表達是下降的，而微衛星穩定的腫瘤中COX-2的表達相對較高。在食管癌MSI與COX-2的研究中，基本與其他腫瘤一致。王宏霞等［24］經研究發現MSI食管鱗狀細胞癌COX-2蛋白的表達率與MSS食管鱗狀細胞癌有顯著差別。COX-2多在MSS食管鱗狀細胞癌中呈高表達，而在MSI食管鱗狀細胞癌表達降低，表明COX-2與MSI食管鱗狀細胞癌的發生關系不大，而與MSS食管鱗狀細胞癌的發生關系密切。提示在食管鱗狀細胞癌發生發展過程中存在MSI途徑，并常伴有COX-2低表達。

3 MSI的檢測

3.1 檢測方法

檢測MSI的方法很多:變性凝膠電泳，變性高效液相色譜分析，免疫組化法，聚合酶鏈式反應(PCR)，PCR-單鏈構象多態性分析(SSCP)法，體外偶聯的轉錄翻譯技術(IVTT)等。目前較多應用的是PCR檢測法，它是對DNA片段進行擴增，對其長度進行直接檢測，具有敏感性高，穩定性好等優點，在臨床及科研中廣泛應用。

近年來，自動測序儀片段分析MSI這一檢測方法正被越來越多地采用，特別是高通量雙熒光標記微衛星檢測系統(high resolution microsatellite analysis system，HRFMA)，因其能夠解決傳統方法的大部分問題，已備受關注［25］。HRFMA法是用帶有2種熒光標記的引物以Taq聚合酶分別擴增待測樣本和對照樣本基因組DNA的靶序列，然后將PCR產物作變性處理后等量混合，再用測序儀對自動片段進行分析。在自動片段分析技術中，波形的位置表示PCR產物的精確長度，波形的高低表示PCR產物的相對量。同時電泳待測樣本的擴增序列和對照樣本擴增系列，可以直接比較結果，進而消除兩者因泳動率產生的誤差。

3.2 檢測標本

目前對MSI進行檢測多選用腫瘤標本，也有選用尿液、胸腹腔積液等的。國內張樹鵬等［26］應用多重熒光PCR、基因測序和FISH法分別檢測尿液細胞DNA MS的不穩定性，結果顯示，經上述方法檢測，早期確診和提高體液癌細胞陽性率(90%)。且指出細胞HE染色后也可以進行MSI的檢測，適于晚期腫瘤胸腹腔積液的檢查。

此外，LIU Ming等［27］選用食管癌患者的血清樣本檢測，判斷腫瘤組織中是否存在MS變化。結果顯示，食管癌患者血清中微衛星缺失檢出陽性率超過90%，由此認為，血清MSI分析將有助于從高危人群中檢出早期食管癌患者。但對血清樣本MSI分析存在臨床應用的可行性。通過血清樣本的MS分析可判定早期食管癌及食管癌的高危人群中惡性腫瘤的存在，循環血血清中DNA的微衛星缺失有望成為新一代的腫瘤分子標記物。

MSI分析的可操作性就在于它能在多種不同的樣本中進行，如血清和各種體液。通過檢測MSI，可發現早期食管癌及高危人群，且檢測MSI方法簡便，價錢低廉，結果可靠，可以作為1種新型的、有效的用于預測腫瘤發生及早期診斷腫瘤的分子手段進行推廣，對提高食管癌的預防、診斷和治療水平，對降低食管癌的發病率和死亡率有著重要的意義，具有潛在的、巨大的、樂觀的應用前景。我們相信，隨著食管癌發生機制的進一步闡明，未來會有更多的分子標記物用于患者的診斷和治療。

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