人參皂甙Rg3對(duì)乳腺癌MCF-7線粒體凋亡途徑的影響

孫秀英 王伏生

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管乳腺外科，山西太原030001）

全球范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害廣大婦女的身心健康。人參皂甙Rg3為近年從人參根的浸出液中分離出的一種有效單體成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)其凋亡的作用。臨床試驗(yàn)表明應(yīng)用人參皂甙Rg3不僅可以提高肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌患者的化療效果，同時(shí)能明顯改善化療后氣虛癥的臨床癥狀，有增效解毒的作用[1]。本研究觀察了20（R）–人參皂甙Rg3對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并初步探討其分子機(jī)制，為乳腺癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院。20（R）-人參皂甙Rg3購(gòu)于南京替斯艾么中藥研究所，純度99.00%，二甲基亞砜（DMSO）助溶，DMSO終濃度＜0.1%，用完全培養(yǎng)基配置成600μg/mL的儲(chǔ)存液，抽濾除菌后分裝，保存于-20℃冰箱中備用。10%胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于上海源智生化科技有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液均由山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。6孔板，96孔板。一抗為兔多克隆抗體，二抗（羊抗兔）試劑盒均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（Forma Series2，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)d1-1N（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司）；OLYMPUS多功能顯微鏡（BX51，日本）；流式細(xì)胞儀（Becon Dickinson Facscalibur，美國(guó)）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（B10AX70-red 550，日本）。

1.3 方法

1.3.1 20（R）–人參皂甙Rg3的配制和細(xì)胞培養(yǎng) 20（R）–人參皂甙Rg3用DMSO溶解，使用前用含10%新生牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，使DMSO終濃度＜0.1%。MCF-7細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.3.2 MTT法測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（1×105）個(gè)/mL。接種于96孔板中，每孔200μL，同時(shí)每孔設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液后，空白對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入DMSO，實(shí)驗(yàn)組各加入不同濃度的人參皂甙Rg3，使其質(zhì)量濃度分別為37.5、75、150、300、600μg/mL。每種濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別在加藥后24、48、72h，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，加入150μL DMSO，搖床上振蕩10min使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定每孔光吸收值（A值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并求算出半數(shù)抑制濃度（IC50）。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A570處吸光值/對(duì)照組A570處吸光值）×100%

1.3.3 流式細(xì)胞儀分析300μg/mL人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 收集0μg/mL、300μg/mL作用48h的MCF-7細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，濃度為106/mL，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，1000r/min離心去除PBS，70%的酒精固定，4℃保存2h，再次以1000r/min離心棄去固定液，PBS洗滌3次，1000r/min離心棄去PBS液，用1mL PI染液染色，4℃避光30min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

表1 人參皂甙R g3對(duì)M CF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

1.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞色素C蛋白含量 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，接種于6孔板蓋玻片上貼壁生長(zhǎng)，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后換液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的人參皂甙Rg3，使其終濃度分別為0、300μg/mL。培養(yǎng)48h后，吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10~15min，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min，同種動(dòng)物血清封閉10min，加入兔抗細(xì)胞色素C多克隆抗體，4℃過(guò)夜，以后步驟按免疫組化SABC試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察分析。以胞漿、胞膜出現(xiàn)明顯棕褐色顆粒，其強(qiáng)度大于背景非特異性染色者判定為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。低倍鏡下找到5個(gè)不重復(fù)視野，高倍鏡下（400×）計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及半數(shù)抑制濃度

20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且抑制率隨著其濃度的增加而增大。20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的24、48、72h半數(shù)抑制濃度IC50均為244.54μg/mL。

球形檢驗(yàn)結(jié)果顯示，近似卡方值為4.759，P=0.093，滿足直接進(jìn)行一元方差分析的Huynh-Feldt條件。利用SNK法可知，實(shí)驗(yàn)對(duì)照和空白對(duì)照間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由線性趨勢(shì)圖可知，600μg/mL組的抑制效果最強(qiáng)，并且隨著劑量增加，抑制效果越來(lái)越明顯。見(jiàn)表1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，300μg/mL的20（R）-人參皂甙Rg3作用于MCF-7細(xì)胞48h后S期細(xì)胞明顯增多（P＜0.01），G2-M期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C含量的影響

細(xì)胞色素C蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示：對(duì)照組MCF-7細(xì)胞呈多邊形，胞漿內(nèi)無(wú)棕褐色顆粒出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)正常；20（R）-人參皂甙Rg3作用于MCF-7細(xì)胞48h后細(xì)胞胞漿呈深棕黃色，顆粒密、粗，著色細(xì)胞數(shù)達(dá)31%。實(shí)驗(yàn)組胞漿中細(xì)胞色素C含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 20（R）-人參皂甙Rg3對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C含量的影響

3 討論

我國(guó)是乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家之一[2]，目前乳腺癌主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療。耐藥性及西藥化療的副作用已經(jīng)成為腫瘤化療過(guò)程中的主要難題[3]。近年來(lái)，人們一直致力于尋找一種新的治療腫瘤的天然藥物。20（R）–人參皂甙Rg3是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥人參中提取出的單體成分，其抗腫瘤作用顯著，可以通過(guò)多種作用機(jī)制抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)，大量的研究證據(jù)表明，線粒體通路又是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路[5]。盡管凋亡信號(hào)多種多樣，細(xì)胞類型也各不相同，但凋亡信號(hào)大多在線粒體水平整合和放大。線粒體經(jīng)凋亡信號(hào)激活后，能夠釋放許多促凋亡因子至細(xì)胞漿中，如細(xì)胞色素C等，激活下游凋亡信號(hào)。細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)后，可與Apaf-1的羧基端結(jié)合，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-CytC多聚復(fù)合體，此復(fù)合體與Pro-Caspase-9互相作用募集細(xì)胞質(zhì)中的 Pro-Caspase-9，Pro-Caspase-9酶原間相互靠近，自我剪切而活化。凋亡體內(nèi)活化的Caspase-9作為蛋白酶激活下游的Caspase家族如Caspase-3、Caspase-7等凋亡效應(yīng)蛋白，繼而引起細(xì)胞核濃縮及DNA裂解，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。

由以上結(jié)果推斷人參皂甙Rg3作用MCF-7細(xì)胞后，破壞細(xì)胞線粒體，使之將細(xì)胞色素C釋放到胞漿，從而激活Caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它為將來(lái)人參皂甙Rg3應(yīng)用于乳腺癌治療提供理論依據(jù)，但人參皂甙Rg3的抗癌作用還可能存在其他途徑，有待進(jìn)一步研究。

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