人參皂甙Rg3對乳腺癌MCF-7線粒體凋亡途徑的影響

孫秀英 王伏生

（1.山西醫科大學，山西太原030001；2.山西醫科大學第二附屬醫院血管乳腺外科，山西太原030001）

全球范圍內乳腺癌的發病率呈上升趨勢，嚴重危害廣大婦女的身心健康。人參皂甙Rg3為近年從人參根的浸出液中分離出的一種有效單體成分，具有抑制腫瘤細胞生長、促進其凋亡的作用。臨床試驗表明應用人參皂甙Rg3不僅可以提高肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌患者的化療效果，同時能明顯改善化療后氣虛癥的臨床癥狀，有增效解毒的作用[1]。本研究觀察了20（R）–人參皂甙Rg3對乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制和誘導凋亡作用，并初步探討其分子機制，為乳腺癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7細胞購于中國醫學科學院腫瘤醫院。20（R）-人參皂甙Rg3購于南京替斯艾么中藥研究所，純度99.00%，二甲基亞砜（DMSO）助溶，DMSO終濃度＜0.1%，用完全培養基配置成600μg/mL的儲存液，抽濾除菌后分裝，保存于-20℃冰箱中備用。10%胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM培養基購于上海源智生化科技有限公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液均由山西醫科大學中心實驗室提供。6孔板，96孔板。一抗為兔多克隆抗體，二抗（羊抗兔）試劑盒均購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫培養箱（Forma Series2，美國）；超凈工作臺d1-1N（北京東聯哈爾儀器有限公司）；OLYMPUS多功能顯微鏡（BX51，日本）；流式細胞儀（Becon Dickinson Facscalibur，美國）；酶聯免疫檢測儀（B10AX70-red 550，日本）。

1.3 方法

1.3.1 20（R）–人參皂甙Rg3的配制和細胞培養 20（R）–人參皂甙Rg3用DMSO溶解，使用前用含10%新生牛血清的L-DMEM培養液稀釋成所需濃度，使DMSO終濃度＜0.1%。MCF-7細胞貼壁培養于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的L-DMEM培養液中，置37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱。

1.3.2 MTT法測細胞活性 取對數生長期細胞，消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制成單個細胞懸液，調節細胞濃度為（1×105）個/mL。接種于96孔板中，每孔200μL，同時每孔設空白對照組。培養24h，更換培養液后，空白對照組不加藥，實驗對照組加入DMSO，實驗組各加入不同濃度的人參皂甙Rg3，使其質量濃度分別為37.5、75、150、300、600μg/mL。每種濃度設4個復孔，分別在加藥后24、48、72h，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃繼續培養4h后棄上清液，加入150μL DMSO，搖床上振蕩10min使藍紫色結晶充分溶解，用酶標儀于570nm處測定每孔光吸收值（A值），計算細胞生長抑制率，并求算出半數抑制濃度（IC50）。按下列公式計算腫瘤細胞生長抑制率：腫瘤細胞生長抑制率=（1-實驗組A570處吸光值/對照組A570處吸光值）×100%

1.3.3 流式細胞儀分析300μg/mL人參皂甙Rg3對MCF-7細胞周期的影響 收集0μg/mL、300μg/mL作用48h的MCF-7細胞，制備單細胞懸液，濃度為106/mL，1000r/min離心5min，棄去培養液，PBS洗滌3次，1000r/min離心去除PBS，70%的酒精固定，4℃保存2h，再次以1000r/min離心棄去固定液，PBS洗滌3次，1000r/min離心棄去PBS液，用1mL PI染液染色，4℃避光30min，在流式細胞儀上檢測。

表1 人參皂甙R g3對M CF-7細胞增殖的抑制作用

1.3.4 免疫細胞化學法檢測細胞色素C蛋白含量 收集對數生長期MCF-7細胞，胰蛋白酶消化后，接種于6孔板蓋玻片上貼壁生長，5%CO2的飽和濕度培養箱中培養24h后換液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋的人參皂甙Rg3，使其終濃度分別為0、300μg/mL。培養48h后，吸棄培養液，4%多聚甲醛固定10~15min，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10min，同種動物血清封閉10min，加入兔抗細胞色素C多克隆抗體，4℃過夜，以后步驟按免疫組化SABC試劑盒說明進行。最后DAB顯色，蘇木素復染，鏡下觀察分析。以胞漿、胞膜出現明顯棕褐色顆粒，其強度大于背景非特異性染色者判定為陽性標準。低倍鏡下找到5個不重復視野，高倍鏡下（400×）計數200個細胞。

1.3.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗分析。

2 結果

2.1 MTT法測定20（R）-人參皂甙Rg3對腫瘤細胞生長抑制作用及半數抑制濃度

20（R）-人參皂甙Rg3對MCF-7乳腺癌細胞生長有明顯的抑制作用，且抑制率隨著其濃度的增加而增大。20（R）-人參皂甙Rg3對MCF-7乳腺癌細胞的24、48、72h半數抑制濃度IC50均為244.54μg/mL。

球形檢驗結果顯示，近似卡方值為4.759，P=0.093，滿足直接進行一元方差分析的Huynh-Feldt條件。利用SNK法可知，實驗對照和空白對照間差異無統計學意義，其余各組間差異均有統計學意義。由線性趨勢圖可知，600μg/mL組的抑制效果最強，并且隨著劑量增加，抑制效果越來越明顯。見表1。

2.2 流式細胞術檢測20（R）-人參皂甙Rg3對細胞周期和細胞凋亡率的影響

流式細胞術檢測結果顯示與對照組比較，300μg/mL的20（R）-人參皂甙Rg3作用于MCF-7細胞48h后S期細胞明顯增多（P＜0.01），G2-M期細胞明顯減少（P＜0.05），MCF-7細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 Rg3對MCF-7細胞周期和細胞凋亡率的影響

2.3 20（R）-人參皂甙Rg3對MCF-7腫瘤細胞胞漿內細胞色素C含量的影響

細胞色素C蛋白免疫細胞化學法結果顯示：對照組MCF-7細胞呈多邊形，胞漿內無棕褐色顆粒出現，細胞形態正常；20（R）-人參皂甙Rg3作用于MCF-7細胞48h后細胞胞漿呈深棕黃色，顆粒密、粗，著色細胞數達31%。實驗組胞漿中細胞色素C含量明顯高于對照組（P＜0.01）。見表3、圖2。

表3 20（R）-人參皂甙Rg3對MCF-7腫瘤細胞胞漿內細胞色素C含量的影響

3 討論

我國是乳腺癌發病率增長最快的國家之一[2]，目前乳腺癌主要治療方法包括手術、化療、放療以及靶向治療。耐藥性及西藥化療的副作用已經成為腫瘤化療過程中的主要難題[3]。近年來，人們一直致力于尋找一種新的治療腫瘤的天然藥物。20（R）–人參皂甙Rg3是我國傳統中草藥人參中提取出的單體成分，其抗腫瘤作用顯著，可以通過多種作用機制抑制腫瘤的生長和轉移[4]。

誘導細胞凋亡是抗腫瘤藥物發揮作用的重要環節，大量的研究證據表明，線粒體通路又是細胞凋亡信號傳導的重要通路[5]。盡管凋亡信號多種多樣，細胞類型也各不相同，但凋亡信號大多在線粒體水平整合和放大。線粒體經凋亡信號激活后，能夠釋放許多促凋亡因子至細胞漿中，如細胞色素C等，激活下游凋亡信號。細胞色素C進入胞質后，可與Apaf-1的羧基端結合，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-CytC多聚復合體，此復合體與Pro-Caspase-9互相作用募集細胞質中的 Pro-Caspase-9，Pro-Caspase-9酶原間相互靠近，自我剪切而活化。凋亡體內活化的Caspase-9作為蛋白酶激活下游的Caspase家族如Caspase-3、Caspase-7等凋亡效應蛋白，繼而引起細胞核濃縮及DNA裂解，使細胞發生凋亡[6]。

由以上結果推斷人參皂甙Rg3作用MCF-7細胞后，破壞細胞線粒體，使之將細胞色素C釋放到胞漿，從而激活Caspase-9，誘導細胞凋亡。它為將來人參皂甙Rg3應用于乳腺癌治療提供理論依據，但人參皂甙Rg3的抗癌作用還可能存在其他途徑，有待進一步研究。

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[4]張南生，張秀華，李文峰.人參皂苷Rg3的研究進展[J].醫藥導報，2006，25（7）：687-689.

[5]詹啟敏.分子腫瘤學[M].北京：人民衛生出版社，2005：38-103.

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