發酵產1，3-丙二醇的關鍵酶研究進展

張宏蕊，金 平，劉樹臣

(1.遼寧石油化工大學環境與生物工程學院，遼寧 撫順 113001；2.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001)

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PDO)是一種重要的化工原料，可直接用作防凍劑，也是增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，廣泛用于食品、化妝品和制藥等行業。1，3-丙二醇目前最主要的消費領域是用作新型聚酯——聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的主要原料[1]。PTT具有良好的染色性、生物可降解性、抗污性，且具有和尼龍相當的韌性、回彈性及抗紫外線性能，其研發生產引起了世界合成纖維行業的重視。我國是聚酯生產大國，但大宗工業用1，3-丙二醇仍需進口，開發1，3-丙二醇是發展新型纖維的關鍵。因此，我國將1，3-丙二醇的生物發酵生產技術開發列為“十五”、“十一五”科技攻關項目[2]。

近年來，國內外對產1，3-丙二醇的不同微生物進行了詳盡研究，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乳酸菌屬(Lactobacillusbrevis)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)等，這些產1，3-丙二醇的天然菌株中含有的1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)都是以NAD為輔酶，其相關基因的克隆和表達已有較多報道[3～6]。發酵生產1，3-丙二醇的過程中，各代謝途徑中酶的作用舉足輕重。作者在此就近年來國內外對發酵產1，3-丙二醇的關鍵酶的研究進行了綜述。

1 1，3-丙二醇氧化還原酶

肺炎克雷伯氏菌發酵生產1，3-丙二醇的過程是以甘油為底物，在甘油脫水酶(GDHt)的作用下轉化為中間產物3-羥基丙醛；3-羥基丙醛在1，3-丙二醇氧化還原酶的催化下生成1，3-丙二醇。甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶是該代謝途徑中的關鍵酶，其相關編碼基因dhaB及dhaT已在大腸桿菌(Escherichiacoli)中獲得成功表達，但dhaT的異源表達活性明顯低于dhaB[7]，容易導致中間產物3-羥基丙醛的積累，3-羥基丙醛會抑制1，3-丙二醇氧化還原酶和甘油脫水酶的活性，進而影響菌體的生長和甘油的代謝[8]，在天然產1，3-丙二醇菌株Klebsiellapneumoniae體內也存在類似問題?？死撞暇鷮偌嫘詤捬蹙?，并且其生理生化特性與大腸桿菌非常相近，這就為基因工程改良菌種和構建基因工程菌奠定了生理基礎[9]。因此，美國DuPont公司構建了產1，3-丙二醇的重組菌株，研究發現，未轉入dhaT基因的重組Escherichiacoli也能產生一定量1，3-丙二醇。表明在Escherichiacoli中必定存在一種非異性的能催化3-羥基丙醛還原反應的醇脫氫酶，在進一步的研究中，將大腸桿菌自身的yqhD基因強化表達后，催化3-羥基丙醛的還原反應得到顯著加強，1，3-丙二醇最終產量達到135 g·L-1[10]。這是由于yqhD基因編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶在微生物體內可代替dhaT基因編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇，并且催化活性遠高于1，3-丙二醇氧化還原酶，同時該酶還能作用于多種含醛基團的底物[11]。

朱建國等[12]以大腸桿菌(Escherichiacoli)基因組為模板，PCR擴增出1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶基因yqhD，經測序確認，將yqhD基因與四環素抗性基因TetR同時插入表達載體pUC18構建重組質粒pUC18-yqhD-TetR，重組質粒轉KlebsiellapneumoniaeME308；經37℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導8 h，重組菌中1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶的酶活力達到4.16 U·mg-1，而對照菌株的酶活力僅為0.62 U·mg-1；將重組菌在搖瓶中進行微氧發酵培養，經IPTG誘導，可將60 g·L-1甘油轉化為33.8 g·L-11，3-丙二醇。

在諸多產1，3-丙二醇的微生物中，肺炎克雷伯氏菌和梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌的產率較高。楊登峰等[13]以丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)基因組DNA為模板，利用PCR技術擴增得到1，3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT。將它連接到pMD 18-T載體上，得到重組質粒pMD-dhaT，對此重組質粒進行序列測定，其DNA序列分析結果表明，dhaT基因全長為1158 bp。將dhaT基因插入表達載體pSE-380中，構建成重組子pSE-dhaT，并在大腸桿菌JM109中進行誘導表達。研究表明，以1，3-丙二醇為底物時，基因工程菌經37℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導14 h，酶活力達到16.28 U·mL-1，比原始菌株提高5～6倍。

2 甘油脫水酶

2.1 甘油脫水酶

生物法合成1，3-丙二醇通常都是以甘油作底物，經甘油脫水酶(編碼基因dhaB)及1，3-丙二醇氧化還原酶(編碼基因dhaT)催化完成。甘油脫水酶在催化甘油轉化為3-羥基丙醛的同時，會出現甘油導致的自殺性失活現象。失活的主要原因是甘油導致輔酶B12的C-Co鍵發生不可逆斷裂，形成5-脫氧腺苷和烷基鈷氨素類似物(即被修飾的輔酶)，同時烷基鈷氨素與脫水酶緊密結合，致使甘油脫水酶發生不可逆性失活[14]。因此，如何使失活的甘油脫水酶復活并提高其催化效率十分重要。

Toraya等將產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中二醇脫水酶編碼基因與其兩側的兩段讀碼框編碼的基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)中共同表達后，其感受態細胞能使失活的甘油脫水酶恢復其催化活性，也能激活甘油脫水酶-氰鈷氨素的復合體。因此，認為這兩段讀碼框可能編碼二醇脫水酶復活蛋白(簡稱激活因子)，分別命名為ddrA和ddrB基因；后來的研究者發現并證實了存在于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的甘油脫水酶激活因子和來源于弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)的激活因子。

來源于不同菌種的激活因子及其編碼基因略有差異，但交叉活化(Cross activatation)研究表明，來源于弗氏檸檬菌的激活因子dhaF-dhaG復合體，還可以有效地激活肺炎克雷伯氏菌中失活的甘油脫水酶及脫水酶—氰鈷氨素的復合體[15]。杜邦公司克隆出orfXor7并與甘油脫水酶編碼基因dhaB及1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD串聯表達，所構建重組菌的1，3-丙二醇產量明顯提高。張曉梅等[16]利用PCR技術擴增來源于弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)的甘油脫水酶編碼基因dhaB以及甘油脫水酶激活因子編碼基因dhaG-dhaF，將其與1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD串聯在溫控表達載體pHsh上，構建重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析顯示，融合表達產物的分子量同核酸序列測定的推導值相符。與未串聯甘油脫水酶激活因子編碼基因的重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比，1，3-丙二醇的產量提高了28%。

2.2 二醇脫水酶

Klebsiellaoxytoca的二醇脫水酶由3個亞基組成，形成一種六聚體結構azB2，需要在輔酶B的輔助下才能有效地進行催化，屬于第Ⅱ類以B12(Adenosylcobalamin，腺苷鈷氨素，AdoCb1)作輔酶的生物催化劑[17～19]。二醇脫水酶的作用主要是與輔酶B12有機結合后產生電子受體，從而將甘油或1，2-丙二醇轉化為相應的醛。二醇脫水酶很容易失活，底物甘油、氧以及輔酶類似物都是可能的誘導因素[20，21]。

Raynaud等研究發現，在以甘油為碳源、不含維生素B12的培養基上培養攜帶有ClostridiumbutyricumVPI 1718的1，3-丙二醇操縱子的E.coli時，能產生1，3-丙二醇并且檢測到很高的甘油脫水酶活性[3，22，23]，其結構與K.oxytoca中依賴輔酶B12的二醇脫水酶沒有同源性。

鄭學瑞[24]從ClostridiumbutyricumDSM 10702基因組中擴增到含甘油脫水酶(一種二醇脫水酶的同功酶，但不依賴于輔酶B12)基因的1，3-丙二醇操縱子，利用表達載體plTK將其轉入1，3-丙二醇生產菌K.oxytocaDA-1HB中，獲得了重組菌K.oxytocaPK，并研究了其生長代謝性能。結果表明，重組質粒穩定性良好，厭氧搖瓶培養時的1，3-丙二醇產量提高了52.7%。

3 GDHt和PDOR的共表達

甘油脫水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)是甘油歧化為1，3-丙二醇的兩個關鍵酶。

曲薈錦等[25]采用多順反子重組和質粒共存兩種策略，對來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的兩個關鍵酶進行共表達。構建表達載體pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT，將兩酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔，在E.coliBL21(DE3)高水平共表達了GDHt 3個亞基和PDOR，表達蛋白分別約占菌體總蛋白的18%、9%、7%和9%。質粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共轉化得到E.coliBL21(DE3)穩定的雙質粒系統，48 h后84%的細胞能同時含有兩種質粒，GDHt 3個亞基和PDOR分別約占菌體總蛋白的16%、8%、6%和11%。

Zeng等[26]對Klebsiellapneumoniae的代謝工程改造進行了大量研究，構建了含有編碼甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶基因的質粒，并將其插入野生菌種中，結果表明這兩個酶的活性得到了大幅提高。但是在實際的發酵過程中，該工程菌并未產出高濃度的1，3-丙二醇。這是因為在Klebsiellapneumoniae1，3-丙二醇合成途徑中，過于加強甘油脫水酶基因表達，導致NADH供應不足而使3-羥基丙醛累積，對菌體生長及1，3-丙二醇合成造成負面影響。

研究發現，來自大腸桿菌的非特異性氧化還原酶是1，3-丙二醇氧化還原酶的同功酶(編碼基因yqhD，以NADPH為輔酶)，它在微生物體內可代替1，3-丙二醇氧化還原酶(以NADH為輔酶)催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇，是微生物轉化甘油生成1，3-丙二醇的另一重要用酶[27，28]。

諸葛斌等[29]為優化Klebsiellapneumoniae1，3-丙二醇的合成途徑，利用PCR技術從大腸桿菌(Escherichiacoli)中擴增出以NADPH為輔酶的1，3-丙二醇氧化還原酶同功酶編碼基因yqhD，從克雷伯氏菌中擴增出2.66 kb的甘油脫水酶基因(dhaB)，構建了產1，3-丙二醇關鍵酶基因的串聯載體pEtac-dhaB-tac-yqhD，并將其轉入到野生肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中，重組載體得到了表達。通過初步發酵，重組后克雷伯氏菌1，3-丙二醇的產量比原始菌提高20%左右，副產物乙酸和丁二醇產量分別下降30%左右。

4 展望

與化學合成法相比，微生物法產1，3-丙二醇具有選擇性好、轉化率高、產物分離較簡單、無環境污染、可利用再生資源等優點，符合當今社會可持續發展和科學發展的要求。微生物法將逐漸取代化學法用于1，3-丙二醇的生產。

未來研究中，可從微生物中提取純化酶并將其商品化；可將酶固定化循環使用，節約成本；可制備模擬酶。模擬酶是根據酶的作用原理，模擬酶的活性中心和催化機制，用化學方法制成高效、高選擇性、比天然酶結構簡單、具有催化活性且穩定性較高的非蛋白質分子的一類新型催化劑。最重要的是，在以后的研究中，必然還會發現與1，3-丙二醇氧化還原酶、甘油脫水酶等具有相同作用的酶，從而有更多菌種可以選擇，以便1，3-丙二醇的生產更普遍、更廣泛。

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