胸苷酸合成酶多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性研究

洪雷 崔雅靜 姜達(dá) 李琰 郭煒 王娜 張健慧

人類胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)是由兩個(gè)相同亞單位組成的二聚體蛋白，其基因定位于第18號染色體上(18p11.32)［1］。TS是DNA生物合成的關(guān)鍵酶，它催化單磷酸去氧尿苷(dUMP)甲基化，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橐涣姿崦撗跣剀?dTMP)。TS活性的抑制將直接影響DNA的合成和細(xì)胞的分裂增值，因此TS是以葉酸為基礎(chǔ)的TS抑制劑化療中的一個(gè)理想靶點(diǎn)［2］。另外，胸苷酸合成反應(yīng)與蛋氨酸、葉酸代謝反應(yīng)偶聯(lián)，對DNA的甲基化和DNA的合成與修復(fù)有重要影響［3］。而個(gè)體的DNA甲基化水平以及DNA修復(fù)能力與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有明顯的相關(guān)性。許多研究表明TS的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［2］。TS高表達(dá)者的增殖抗原表達(dá)、血管侵犯、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移率明顯高于TS表達(dá)低者，因此TS高表達(dá)很可能對預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至遠(yuǎn)處遷徙具有重要作用。本文通過采用PCR-RFLP技術(shù)，檢測研究對象的TS多態(tài)性基因型，探討TS基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇病理診斷明確的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者177例作為NSCLC組。同時(shí)選擇同一醫(yī)院同一時(shí)期體檢人員381例作為對照組。2組患者均來自河北省南部非高發(fā)區(qū)并均為漢族。手術(shù)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息來自手術(shù)記錄。

1.2 標(biāo)本采集及DNA的提取 采集靜脈血5ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，置4℃保存，并于采血后1周內(nèi)，以蛋白酶K消化—飽和氯化鈉鹽析法提取外周血單核細(xì)胞DNA。

1.3 TS 5’UTR和3’UTR多態(tài)性位點(diǎn)基因分型 TS 5’UTR多態(tài)重復(fù)序列基因型檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)體積為25 μl，其中模板DNA100 ng，10×PCR緩沖液 2.5 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR 上游引物 (5’-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3’)和下游引物(5’-GGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG-3’)［4］各 200 nmol。PCR 反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性5min，然后94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3%的瓊脂糖凝膠電泳分析。預(yù)期2R、3R等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別為243 bp和215 bp。使用HaeIⅡ酶切對3R等位基因G→C SNP進(jìn)行分型。酶切產(chǎn)物進(jìn)行4% 的瓊脂糖電泳分析，含 66-，47-，45-，44-，28-和 13-bp 片段的為 3G 等位基因，含 94-，47-，45-，44-和 13-bp 片段的為 3C 等位基因。

TS 3’UTR 6 bp核苷酸片段的缺失或插入多態(tài)性分析采用PCR-RFLP 方法［5］。模板 DNA 100 ng，10 × PCR 緩沖液2.0 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR上游引物(5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’)和下游引物 (5’-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3’)各 150 μmmol/L。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，然后94°C 30 s，58°C 45 s，72°C 45 s，30個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DraⅠ于37°C消化12 h后，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3%的瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。有6 bp插入等位基因(6bp+)顯示70和88 bp片段，無6bp插入等位基因(6bp－)顯示152 bp片段。

每一組PCR反應(yīng)都做一個(gè)陰性對照，用去離子水代替DNA摸板進(jìn)行擴(kuò)增。隨機(jī)取10%的標(biāo)本重復(fù)PCR反應(yīng)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制。

1.4 DNA序列分析 對6個(gè)有代表性的標(biāo)本進(jìn)行TS 5’UTR基因型測序。雜合型的標(biāo)本從瓊脂糖中切取相應(yīng)條帶后以DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，再行PCR擴(kuò)增等位基因型產(chǎn)物。以ABI 377型測序儀行DNA序列測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)比較各位點(diǎn)基因型頻率的觀察值與預(yù)期值并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析，2組的基因型分布比較采用行×列表卡方檢驗(yàn)，2組的單體型頻率計(jì)算及分布比較采用EH軟件(1.2 version，Rockefeller University，New York)進(jìn)行，以非條件 Logistic回歸法計(jì)算表示相對風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，頻率比較行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸煙及家族史對NSCLC易感性的影響 NSCLC組吸煙者比例(59.9%)明顯高于健康組(39.9%)(P ＜0.01經(jīng)性別年齡調(diào)整 OR=2.24，95%CI=1.05～ 3.35)。家族史陽性者(14.7%)顯著高于對照組(4.6%)(χ2=8.62，P=0.003)。

2.2 對照組中TS基因多態(tài)性分布 TS 5’UTR基因分型結(jié)果顯示出4種 PCR 片段，約為210、240、270、300 bp。測序結(jié)果證實(shí)分別代表相同28 bp的2(2R)，3(3R)，4(4R)和5(5R)次重復(fù)等位基因，形成 2R/2R，2R/3R，3R/3R，2R/4R，3R/4R，2R/5R和3R/5R七種基因型。含有3R等位基因個(gè)體進(jìn)一步分析G→C SNP，28bp重復(fù)序列多態(tài)和G→C SNP聯(lián)合確定TS 5’UTR多態(tài)性。對照組中5’UTR的等位基因頻率分別為33.7%(3G)，45.0%(3C)，20.4%(2R)和 0.9%(4R 和 5R);基因型頻率分別為 16.5%(3G/3G)，21.8%(3G/3C)，24.7%(3C/3C)，12.1%(2R/3G)，18.4%(2R/3C)和 4.7%(2R/2R)，其中2R/4R(0.3%)，3C/4R(0%)，2R/5R(0.5%)和 3R/5R(0)基因型在中國北方人口中出現(xiàn)頻率較少。TS 3’UTR 6bp缺失或插入基因型檢測:對照組中6bp－/6bp－、6bp+/6bp－和6bp+/6bp+基因型頻率分別為45.4%，45%和9.2%;6bp+和6bp－等位基因頻率分別為68.0%和32.0%。兩種TS多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，在對照組中的基因型分布與年齡、性別、吸煙狀態(tài)無關(guān)。單倍體分析顯示6bp－/3C在正常對照中出現(xiàn)頻率最高(30.7%)，其他依次為 6bp －/3G(26.8%)，6bp+/3C(15.8%)，6bp+/2R(8.5%)，6bp － /2R(17.2%)，6bp+/3G(4.0%)。采用 EH軟件進(jìn)行連鎖不平衡的分析結(jié)果顯示，與其他一些人口相同［5，6］，TS 5’UTR 和3’UTR 多態(tài)性在中國北方人口中存在明顯連鎖不平衡(D’=0.26，χ2=37.35，P ＜0.01)。6bp － 等位基因易與3R(3G或3C)等位基因連鎖。

2.3 NSCLC組與對照組中TS基因5’UTR和3’UTR基因型和等位基因型多態(tài)性分布比較 5’UTR和3’UTR的各基因型、等位基因型單獨(dú)分析在地2組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但當(dāng)我們聯(lián)合TS 5’UTR和3’UTR基因型進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn):同時(shí)攜帶3C/3C及6bp+/6bp+基因型的個(gè)體患NSCLC的危險(xiǎn)性顯著低于攜帶其他基因型組合的個(gè)體(年齡、性別校正 OR=0.25，95%CI=0.06-0.95)。

2.4 TS單體型對NSCLC易感性的影響 單體型總體分布在NSCLC組中與對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。然而，6bp+/2R單體型在NSCLC患者組出現(xiàn)頻率(8.5%)顯著低于健康對照組(13.0%)(χ2=5.034，P=0.025)。6bp+/2R單倍體型顯著減低NSCLC的發(fā)病危險(xiǎn)性(OR=0.5895 %CI=0.26～0.93)。

2.5 TS基因多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 在有腫瘤侵潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料的116例NSCLC患者中，未觀察到TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＞0.05)。

3 討論

TS基因是多態(tài)的，TS基因多態(tài)性與多種腫瘤的預(yù)后、化療敏感性甚至化療毒性相關(guān)。TS基因5’端轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)上游存在一28 bp多態(tài)性重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)包括兩次(2R)、三次(3R)或更多次數(shù)［7］;Shintani Y 等［8］發(fā)現(xiàn)，在 70 例Ⅰ期和Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌患者中，3R/3R基因型肺癌組織表達(dá)水平以及蛋白水平較2R/2R，2R/3R高。雖然迄今為止眾學(xué)者在TS5’端基因型是否與mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的問題上還存在分歧［9，10］，但體內(nèi)外研究顯示，3R等位基因型的蛋白表達(dá)效率均高于2R［4，11］。在3R的第二次重復(fù)序列存在G→C的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)。含G的3R序列(3G)表達(dá)效率較含有C的3R序列和2R序列高3～4倍［12，13］。3G基因型與TS mRNA高表達(dá)有關(guān)［5］。另外，在TS mRNA3’非編碼區(qū)的1494b處存在6 bp核苷酸片段的缺失或插入［14］;報(bào)道顯示，6 bp缺失的等位基因型 (6bp－)在體內(nèi)減低mRNA的穩(wěn)定性，在體外使腫瘤細(xì)胞TS表達(dá)水平降低［6，15］。

NSCLC約占肺癌患者的80%，其中2/3的患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會［16，17］。而且，傳統(tǒng)的診斷在方法上和診斷意義上還不能滿足我們臨床人員進(jìn)行廣泛普查、早期診斷、臨床觀察和隨訪。因此，找到行而有效的早期診斷手段以及檢測綜合治療敏感與否的指標(biāo)是當(dāng)今NSCLC研究的一個(gè)重要課題。

吸煙可能會使血液中的B族維生素包括葉酸的水平降低，而低葉酸水平是引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定和癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)鍵因素［18］。而某一類人群易于受到某些有害物質(zhì)的侵?jǐn)_患病，而把這種體質(zhì)傳給下一代，這種現(xiàn)象被稱之為遺傳易感性。雖說環(huán)境以及遺傳因素在肺癌發(fā)病過程中不是直接病因，但是它被認(rèn)為是重要的促進(jìn)因素。正如本研究結(jié)果，吸煙以及家族史陽性者患NSCLC的危險(xiǎn)性明顯增加。

胸苷酸合成酶多態(tài)性基因與腫瘤易感性相關(guān)［19－22］。TS高表達(dá)的個(gè)體對腫瘤易感，而TS基因型多態(tài)性能夠影響TS蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平，因此TS基因型多態(tài)很有可能是我們評估腫瘤易感的重要指標(biāo)。但是我們的研究結(jié)果顯示，無論是5’UTR重復(fù)序列多態(tài)，SNP還是3’UTR插入或缺失多態(tài)都不單獨(dú)影響個(gè)體對NSCLC的易感性。然而當(dāng)我們聯(lián)合5’UTR和3’UTR多態(tài)性基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):與同時(shí)攜帶6bp－/6bp－/3G/3G基因型的個(gè)體相比，同時(shí)攜帶3C/3C及6bp+/6bp+基因型的個(gè)體患NSCLC的危險(xiǎn)性要降低4倍。根據(jù)現(xiàn)有資料，3C單體型基因表達(dá)效率比3G單體型要低，而且目前多數(shù)認(rèn)為6bp+單體型個(gè)體體內(nèi)TS mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)率要高于其他各基因型。TS活性增加可以給支氣管上皮細(xì)胞提供充足的核苷酸原料，加速支氣管上皮的新陳代謝，從而實(shí)現(xiàn)對支氣管上皮的保護(hù)作用，那么我們的結(jié)果是與目前大多數(shù)的研究結(jié)果是相吻合的。但是，當(dāng)分析TS單體型聯(lián)合作用與NSCLC易感性是否相關(guān)時(shí)，我們并沒有得到6bp+/3C單體型可以降低NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)性的預(yù)期結(jié)果，而發(fā)現(xiàn)6bp+/2R單體型在減少NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)上有顯著意義。6bp+/2R單體型包含一個(gè)引起TS低表達(dá)的2R等位基因和一個(gè)引起TS高表達(dá)的6bp+等位基因，而結(jié)果是顯著降低NSCLC發(fā)病危險(xiǎn)性。我們考慮:(1)TS 5’UTR和3’UTR多態(tài)性聯(lián)合對TS轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響并不是一個(gè)簡單的加合作用，而且我們也很難用簡單的加減來解釋;(2)多態(tài)性基因型能否影響基因三維構(gòu)象從而影響基因功能尚需進(jìn)一步探討;(3)環(huán)境-基因之間的相互作用非常復(fù)雜，它不是單基因的作用而是多基因的聯(lián)合作用;(4)當(dāng)然，這也有可能是由于樣本量小而出現(xiàn)的一個(gè)偶然結(jié)果，我們會加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證;(5)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對不同病理類型進(jìn)行分層分析的結(jié)果值得期待。另外，由于我們這項(xiàng)研究中因?yàn)槿狈M織標(biāo)本，因此未加入對TSmRNA轉(zhuǎn)錄及其穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)的檢測。我們通過對116例由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料患者TS多態(tài)的觀察，未發(fā)現(xiàn)TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＞0.05)，這與 Miyamoto等［22］的研究結(jié)果相符。

總之，TS 5’UTR重復(fù)序列多態(tài)性、SNP和3’UTR缺失多態(tài)性聯(lián)合分析可作為預(yù)測NSCLC易感性的標(biāo)志，而TS 5’UTR及3’UTR多態(tài)性與中國北方人群肺非小細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

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