骨髓間充質干細胞治療椎間盤退變的研究進展

李梓瑞，徐宏光

(皖南醫學院弋磯山醫院脊柱外科 安徽蕪湖 241001)

骨髓中除含有造血干細胞外，還含有另一類由中胚層發育的早期細胞［1］，稱之為間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。造血干細胞是血細胞和破骨細胞的起源，而間充質干細胞是成骨細胞的起源，間充質干細胞具有強大的增殖能力及多向分化潛能，MSCS主要存在于結締組織和器官基質中，以骨髓中含量最多。在不同的誘導條件下，可以向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成纖維細胞分化的能力［2］。

1 BMSC的發現及特點

140年前德國的Cohnheim就提出骨髓內存在有非造血系統的干細胞，并首次提出了這些干細胞參與組織損傷修復的假設［1］，他在損傷修復的實驗中用一種可溶性的染料analine注入動物的靜脈，經過一段時間，就能夠在傷口的周圍找到一些被染色的細胞，這些細胞不僅含有炎性細胞，也包括一些纖維細胞樣的細胞。1976年，Friedenstein［3］發現了一類易于粘附于塑料培養板表面的細胞，并以充分的證據證明了這些細胞在體內處于睡眠狀態。而在體外，在一定條件的刺激下，可以誘導生成類似于軟骨碎片的細胞集落，1984年Owen［4］首先將這種貼壁生長的細胞，定義為骨髓間充質干細胞。MSCs是呈成纖維樣形態，貼壁成長為三角形和梭形。細胞間呈漩渦狀排列，是間充質干細胞特有的排列方式，電鏡下可見細胞核大，呈圓形，染色質豐富，核漿多，細胞器較少。

2 椎間盤退變機制

椎間盤由髓核、纖維環和軟骨終板構成。椎間盤細胞包括脊索細胞、類軟骨細胞和成纖維細胞。椎間盤退變所引發的腰腿痛是臨床的常見病，是以軟骨終板、髓核、纖維環的組成成分的改變為基礎，導致其力學性能的降低。主要病理改變為髓核細胞減少，使髓核組織中Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量也減少。目前，椎間盤退變的確切機制仍未完全清楚，An等［5］認為，生物學和生物力學是引起椎間盤退變的首要因素，其次是細胞因子、轉化生長因子、基質降解酶等通過旁分泌或自分泌的形式調控椎間盤的細胞活性，導致基質的合成和分解完全失衡，也就是合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖減少，不能滿足椎間盤細胞的需要，從而引起椎間盤退變。

3 椎間盤退變的治療

目前椎間盤退變的治療方法主要有手術治療、細胞移植治療、組織工程學治療等。

3.1 手術治療 現在臨床上椎間盤退變大多數采取手術治療，手術治療雖然能夠有效的緩解臨床癥狀，但還是不能從根本上修復退變的椎間盤，反而可能會因為手術創傷，使椎間盤結構遭到進一步的破壞，癥狀加重，使病人更加痛苦。

3.2 細胞移植治療 細胞移植治療是將自體的椎間盤細胞再移植到退化的椎間盤，延緩椎間盤的進一步退化。Gruber［6］研究證明將自體髓核細胞植入能有效的緩解椎間盤退變，但是自體來源的椎間盤細胞非常有限，無法滿足自體椎間盤細胞再植入的要求。

3.3 組織工程學治療 組織工程學治療就是利用MSCs具有多向分化潛能的特點，在體外培養擴增，并在一定的環境和因素的誘導下，使其分化成類髓核細胞，同時骨髓間充質干細胞還可以為髓核細胞提供一個適宜的外環境，營養髓核細胞，使軟骨基因改變和繼續保持其分化增殖［7］，使軟骨修復成為可能。BMSCs獲取較方便，且能夠在體外培養迅速增殖，連續傳代而保持分化潛能不變，是組織工程中理想的種子細胞。Sakai等［8，9］在動物體內就骨髓間充質干細胞如何修復椎間盤的退化進行試驗，結果顯示，移植過BMSCs的椎間盤內，其蛋白多糖的含量明顯恢復，且細胞外基質的基因高度表達，分化的BMSCs也表現出髓核細胞的表型。Risbud等［10］研究也證明，在適宜的環境條件下，BMSCs能分化成髓核細胞，并且合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原，從而達到修復軟骨，延緩椎間盤進一步退變的目的。因此可以認為間充質干細胞是組織工程研究的主要細胞來源，利用MSCs分化功能的組織工程學治療目前漸漸成為治療椎間盤退變的重要手段。

4 BMSCs分化的影響因素

4.1 低氧環境對 BMSCs的影響 Risbud等［10］在對BMSCs向髓核細胞分化的實驗中，模擬了椎間盤的低氧環境，結果表明在低氧的環境下，分化后的干細胞在基因水平和蛋白水平都表達了髓核細胞外基質，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

4.2 支架材料對BMSCs的影響 較理想的支架材料應該與椎間盤基質成分類似，能夠體現體內椎間盤三維環境，具有生物降解性，生物相容性和力學特性等特點。目前研究最多的是多聚左旋乳酸支架，Richardson等［11］在多聚左旋乳酸支架上用腺病毒(Ad)－sox－9基因來誘導骨髓間充質干細胞，結果表明BMSC分化后有蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達，證明了人骨髓間充質干細胞在多聚左旋乳酸支架上可以向髓核細胞方向分化。劉建華等［12］也通過實驗證明了左旋乳酸共聚物支架可作為軟骨組織工程支架。當然，不同的支架材料，所起到的作用也有所不同，有的促進BMSCs增殖，有的使BMSCs向類軟骨細胞分化，這給BMSCs的分化提供了很好的指導方向。

4.3 細胞生長因子對BMSCs的影響 軟骨組織中含有多種生長因子，他們通過自分泌或旁分泌的方式，在軟骨分化中起到非常重要的作用。在體外培養中使BMSCs向髓核細胞增殖分化［13］，其中包括 TGF－β(細胞轉化因子)，BMP(骨形態發生蛋白)，IGF(胰島素樣生長因子)等。TGF－β是一族廣泛存在、具有多種功能的多肽類生長因子，在人體中已發現了5種類型的 TGF－β，即 TGF －β1、TGF－ β2 、TGF－β3、TGF－β4、TGF－β5。TGF－β能使軟骨細胞合成蛋白多糖增加，而且還能維持基質中蛋白多糖的濃度。Dounchis等［14］研究還證明了TGF－β能刺激BMSCs增殖分化成軟骨細胞，并表達Ⅱ型膠原。骨形態發生蛋白主要是通過TGF－β/Smad信號轉導途徑誘導BMSC向成骨細胞增殖分化［15］。胰島素樣生長因子是一種很強的合成代謝刺激因子，不僅促進BMSC向軟骨細胞分化，還能夠抑制因為TGF－β引起的細胞外焦磷酸鹽的過多聚集，防止形成焦磷酸鹽結晶［16］。總的來說，如果單獨應用BMP、IGF、FGF等，并不能誘導BMSC向軟骨細胞分化，它們主要是輔助TGF－β來發揮作用，與TGF－β之間具有協同作用。TGF－β仍然是最強的細胞促生長因子，并且Indrawattana等［17］研究證明TGF－β3是誘導BMSC分化為軟骨細胞最主要生長因子。

4.4 信號傳導調控對BMSCs的影響 骨髓間充質干細胞的分化和增殖是需要通過一系列的信號轉導途徑來實現。目前研究較多的是轉化生長因子/Smad信號轉導途徑，它由轉化生長因子，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的轉化生長因子受體及受體底物Smad蛋白組成，絲裂原活化蛋白激酶介導的通路是誘導BMSC分化增殖成成骨的主要途徑。Wnt信號通路是當前骨代謝研究的新方向［18］，研究表明，Wnt分泌蛋白對細胞分化、遷移等具有調節的作用，并且在wnt信號轉導通路中，Wnt配體與Frizzled受體相結合，激活成骨細胞形成［19］。

5 展望

椎間盤的退行性變，一直困擾著醫學界，隨著對骨髓間充質干細胞的研究，為椎間盤退化的治療提供更好的方法和途徑。但是目前的研究還只是在動物實驗模型中移植MSC取得較好的進展，要進入臨床治療還有許多問題需要解決:①動物的椎間盤模型與人的椎間盤在結構和功能上，還是有一定的差異，且與人的椎間盤退化的機制也不完全相同。②BMSC分化成髓核細胞的精確顯型還不是十分清楚。③由于各個細胞的復雜性和廣泛性，如何使各個細胞處于最佳狀態，使相互間的協同作用得到最大的發揮，還需要我們更深入的研究。雖然我們還面臨這些難題，但是我堅信隨著人們對BMSCs更深入的研究，那么應用BMSCs治療椎間盤退變必定成為現實。

［1］Prockop DJ.Marrow Stromal Cells as Stem Cells for Nonhematopoietic Tissues［J］.Science，1997，276(5309):71-74.

［2］Minguell JJ，Erices A，Corget P.Mesenchymal Stem Cells［J］.Experimental Biology and Medicine，2001，226(6):507-520.

［3］Fridenstein.Precursor cells of mechanocytes［J］.Int Rev Cytol，1976，47(5):327-359.

［4］Ashton BA，Eaglesom CC，Bob I，et al.Distribution of fibroblastic cotony-forming cells in rabbit bone marrow and assay of their osteogenic potential by an in vivio diffusion chamber method［J］.Calcifled Tissue International，1984，36(1):83-86.

［5］An HS，Masuda K，Inoue N.Intervertebral disc degeneration biological and biomechanical factors［J］.J Orthop Sci，2006，11(5):541-552.

［6］Gruber HE，Johnson TL，Lesliek K，et al.Autologous Intervertebral Disc Cell Implantation:A Model Using Psammomys obesus，the Sand Rat［J］.Spine，2002，27(15):1626-1633.

［7］Umeda M，Kushida T，Sasal K，et al.Activation of rat nucleus pulposus cells by coculture with whole bone marrow cells collected by the perfusion method［J］.J OrthopRes，2009，27(2):222-228.

［8］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Transplanted to a Rabbit Degenerative Disc Model:Potential and Limitations for Stem Cell Therapy in Disc Regeneration［J］.Spine，2005，30(21):2379-2387.

［9］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebraldisc ［J］.Biomaterials，2006，27(3):335-345.

［10］Risbud MV，Albert TJ，Vresilovic EJ，et al.Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Towards a Nucleus Pulposus-like Phenotype In Vitro:Implications for Cell-Based Transplantation Therapy［J］.Spine，2004，29(23):2627-2632.

［11］Richardson SM，Curran JM，Chen R，et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27(22):4069-4078.

［12］劉建華，王國海，徐棟梁.聚己內酯與左旋聚乳酸共聚物支架的細胞相容性測定及與軟骨細胞體外復合的實驗研究［J］.醫學研究生學報，2009，22(2):131-138.

［13］Chen WH，Liu HY，Lo WC，et al.Intervertebral disc regeneration in an ex vivo culture system using mesenchymal stem cells and plateletrich plasma［J］.Biomaterials，2009，30(29):5523-5533.

［14］Dounchis JS，Goomer RS，Harwood FL，et al.Chondrogenic phenotype of perichondrium-derived chondroprogenitor cells is influenced by transforming growth factor-beta 1［J］.J Orthop Res，1997，15(6):803-807.

［15］Li B.Bone Morphogenetic Protein-Smad Pathway as Drug Targets for Osteoporosis and Cancer Therapy［J］.Endoct Metab Immune Disord Drug Targets，2008，8(3):208-219.

［16］Madry H，Kaul G，Cucchiarini M，et al.Enhanced repair of articular cartilage defects?in vivo?by transplanted chondrocytes overexpressing insulin-like growth factor I(IGF-I)［J］.Gene Ther 2005，12(5):1171-1179.

［17］Indrawattana N，Chen G，Tadokoro M，et al.Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell［J］.Biochem Biophys Res Commum，2004，320(3):914-919.

［18］Kubota T，Michigami T，Ozono K.Wnt signaling in bone metabolism［J］.J Bone Miner Metab，2009，27(3):265-271.

［19］Philipp I，Anfschnaiter R，Ozbek S，et al.Wnt/β-Catenin and noncanonical Wnt signaling interact in tissue evagination in the simple eumetazoan Hydra［J］.Proc Natl Acad，2009，106(11):4290-4295.