兔角膜上皮細胞體外原代培養和鑒定

王 丹，李 彥，孫桂媛，汪 卓

（1.中國醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，遼寧沈陽 110001；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院藥理學實驗教學中心，遼寧沈陽 110016；3.何氏醫學院藥理學教研室，遼寧沈陽 110163）

·論 著·

兔角膜上皮細胞體外原代培養和鑒定

王 丹1，3，李 彥2，孫桂媛1*，汪 卓3*

（1.中國醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，遼寧沈陽 110001；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院藥理學實驗教學中心，遼寧沈陽 110016；3.何氏醫學院藥理學教研室，遼寧沈陽 110163）

目的建立體外原代培養兔角膜上皮細胞簡單經濟實用的方法，并觀察其體外生長的生物學特性。方法采用全角膜組織培養法培養兔角膜上皮細胞并進行傳代培養，通過形態學觀察并應用免疫組織化學方法對細胞進行鑒定。結果兔角膜上皮原代培養第2天，組織邊緣有細胞游出，細胞和細胞核均呈圓形，胞核位于細胞中央或旁中央區；第3天，細胞呈扁平多邊形，相互連接成片；兔角膜上皮原代培養第7天，局部可見懸浮細胞生長；兔角膜上皮細胞培養第2代第2天，細胞生長旺盛，部分細胞貼壁呈片狀多邊形。兔角膜細胞免疫組織化學顯示廣譜角蛋白單克隆抗體陽性。結論全角膜培養角膜上皮細胞簡單實用，可獲得狀態良好的連續傳代擴增的細胞。

角膜；上皮細胞；細胞培養技術；兔

角膜細胞成分培養是現代角膜病研究和治療的基礎，近年來，隨著研究深入，對角膜細胞成分培養提出了更高要求。以往的培養方法復雜，對細胞損傷較大，導致活力降低，為此我們改良了體外原代培養兔角膜上皮細胞的方法，以建立一種簡單、經濟、實用的兔角膜上皮細胞培養方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康新西蘭白兔6只，雌雄不限，體質量2.0～2.5kg。眼部經裂隙燈顯微鏡檢查顯示屈光間質透明，無眼前節病變。

1.1.2 主要試劑和儀器：DMEM/F12（Gibco，USA），胎牛血清（美國GIBCO），CO2培養箱（Hea1 ForceHF121UV），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS CKX41，Japan），廣譜角蛋白單克隆抗體PCK（BOSTER公司）。

1.1.3 培養液的制備：采用DMEM/F12、10%胎牛血清、100×103U/L青霉素和100×103U/L鏈霉素，pH值7.2～7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材：取新西蘭白兔6只，以空氣栓塞法處死，無菌條件下迅速摘取12只眼球，用含有160× 103U慶大霉素的生理鹽水沖洗3～5次，備用。

1.2.2 原代培養兔角膜上皮細胞：在超凈工作臺上將眼球用含有慶大霉素的PBS沖洗3次，沿角膜緣取下完整角膜，用注射器輕劃角膜上皮表面，然后將角膜上皮面朝向培養皿鋪平，將培養皿置于37℃培養箱中，20 min后取出，加入培養基，培養基液面與角膜平齊。置37℃、5%CO2和95%空氣培養箱中培養，第2天補加少許培養液，3d后將角膜移至新培養皿中，再次貼與培養皿，置于培養箱20min后，再加入少許培養基，以獲得新的上皮細胞。每個角膜可以移3～4次。以后每周換液2～3次，每次換半液。

1.2.3 角膜上皮細胞的傳代：原代培養至上皮細胞80%融合后用PBS沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 1mL沖洗1次，再加入消化液1～2 mL，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞變圓，細胞間隙變大或少量細胞脫壁時加入含血清的培養液終止消化，收集細胞懸液，離心6～8min（1 000r/min），計數，接種于培養瓶中（按1∶2或1∶3傳代），3d后首次換液，以后每周更換2～3次，直至細胞完全融合。

1.2.4 免疫組織化學染色：兔角膜細胞培養在24孔板中，待細胞貼壁，移去角膜，吸出培養基，用多聚甲醛固定15min，用PBS浸泡3次，每次5min。加體積分數為95%乙醇溶液于玻片上，置室溫下處理20min后用PBS浸泡3次，每次5min，室溫下自然風干。采用免疫組織化學ABC法染色，加入體積分數為3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，在室溫下放置10min，PBS浸泡3次，每次5min。加入胎牛血清封閉，常溫下孵育10min，吸除多余血清；加入適當濃度的PCK單克隆抗體，置于4℃過夜后吸去多余的液體，再用PBS浸泡3次，每次5min。加入適當濃度的二抗IgG，室溫下放置1h后吸去多余的液體，用PBS浸泡3次，每次5min。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，加入雙蒸水終止，顯微鏡檢查并照像。

2 結 果

2.1 培養細胞的形態學觀察：兔角膜上皮原代培養第2天，組織邊緣有細胞游出，細胞和細胞核均呈圓形，核位于細胞中央或旁中央區（圖1）；第3天，細胞呈扁平多邊形，相互連接成片（圖2）；第7天，局部可見懸浮細胞生長（圖3）；兔角膜上皮細胞第2代培養第2天，細胞生長旺盛，部分細胞貼壁呈片狀多邊形（圖4）。

2.2 兔角膜上皮細胞的鑒定：兔角膜上皮細胞培養3d，呈不規則多邊形生長。免疫組織化學染色顯示兔角膜上皮細胞對廣譜角蛋白單克隆抗體PCK免疫反應較強，胞漿染色陽性（圖5）。

3 討 論

自20世紀50年代細胞培養技術興起以來，角膜細胞的培養在國內外已有不少報道，且培養技術一直不斷改進［1-2］。有關眼表疾病的臨床前與臨床研究日益增多［3-4］，但以往關于角膜細胞的培養技術存在方法復雜（如單層培養法）和培養條件昂貴（如需要在培養液中加入特殊生長因子）等問題。因此，尋求一種取材簡單、經濟實用的培養方法，對眼表疾病、角膜病的基礎研究具有重要意義。

消化法是培養角膜上皮細胞的一種常見方法，操作過程簡便、培養周期短，但消化液的濃度及消化時間不易掌握，細胞活力易受到影響。研究［5］發現，分別使用消化培養法和組織塊培養法培養小鼠角膜上皮細胞，其中80%組織塊培養法的原代培養可成功傳代，而僅12%消化培養法原代培養可成功傳代；兩者差異有統計學意義。傳代培養中，組織塊培養法中55%P1細胞可以傳代超過P10并繼續穩定傳代至少可傳至P25。而消化培養法傳代至P2即不能融合，認為小鼠角膜上皮細胞的培養，組織塊培養法優于消化培養法。本實驗采用全角膜片培養由組織塊培養法衍生而來不需添加其他試劑，實驗操作時間短，能夠很好地保持細胞活力，而且整個角膜片多次重復貼壁，能更大程度地增加獲得的上皮細胞數量。

組織塊貼壁法是一種較為傳統的培養方法，存在著方法復雜、細胞生長緩慢、周期長、細胞成分不單一等問題。也有研究采用全角膜培養法［6］培養上皮細胞，運用機械刮除和差速貼壁相結合的方法進行兔角膜上皮細胞的純化。本實驗采用全角膜培養，為了使角膜上皮細胞更好地游出和貼壁，用針頭輕劃角膜上皮，操作簡單，且不易混有成纖維細胞，能更好地減少對組織的損傷。在細胞原代培養和傳代的培養中，本研究中上皮細胞的形態和鑒定結果與文獻報道一致［6］。

我們認為本實驗可以用于對角膜細胞的離體實驗，可以為角膜離體疾病模型和角膜有關藥物研發提供研究對象。（本文圖見封二）

［1］KAUR H，CHAURASIA SS，AGRAWAL V，et a1.Expression of PDGF receptor-αin cornea1 myofibrob1asts in situ［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（3）：432-434.

［2］屈雷，敬曉棋，閆海龍，等.胎兒角膜上皮細胞分離方法的研究［J］.國際眼科雜志，2009，9（2）：250-253.

［3］AMBROSIORJR，KARA-JOSE N，WILSON SE.Ear1y keratocyte apoptosis after epithe1ia1 scrape injury in the human cornea［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（4）：597-599.

［4］MA P，WANG Z，PFLUGFELDER SC，et a1.To11-1ike receptors mediate induction of peptidog1ycan recognition proteins in human cornea1epithe1ia1 ce11s［J］.Experimenta1Eye Research，2010，90（1）：130-136.

［5］馬小力，劉漢強.小鼠角膜上皮細胞消化培養法和組織塊培養法的比較研究［J］.國際眼科雜志，2011，11（6）：939-942.

［6］石妍，楊帆，葛紅巖，等.改良兔角膜上皮細胞原代培養及純化的方法［J］.眼科新進展，2010，30（7）：612-615.

（本文編輯：趙麗潔）

CULTURE OF RABBIT PRIMARY CORNEAL EPITHELIAL CELLS

WANG Dan1，3，LIYan2，SUN Guiyuan1*，WANG Zhuo3*
（1.Department of Histology and Embryology，the College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Experimental Teaching Center of Pharmacology，the School of Life Scienceand Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；3.Department of Pharmacology，HE's University，Shenyang 110163，China）

ObjectiveTo estab1ish a convenient，economic and pragmatic method for rabbit corhea1 epithe1ia1 ce11s primary cu1ture，and observe the bio1ogic characteristics of growth in vitro.MethodsThe rabbit cornea1 epithe1ia1 ce11s were cu1tured by the entire cornea1 tissue-cu1ture.The morpho1ogica1 characteristics of cu1tured ce11s were observed by inverted phase contrast microscope at various time periods respective1y and the cu1tured ce11swere identified by immunohistochemica1method.ResultsThe rabbit entire cornea adhered in 2 days，the ce11s cou1d be seen c1imbing out from the cornea11imbus.The ce11s and nuc1eiwere spherica1and nuc1eiwere 1ocated next to the centra1area or in the center；The epithe1ia1ce11s were f1at and po1ygona1and connected to each other into membrane in 3 days；Suspension of ce11growth can be seen 1oca11y in 7 days of primary cu1ture；The cornea1epithe1ia1 ce11s grew vigorous1y and some ce11swere adhered and were f1aky and po1ygona1on day 2 of passage 2. The cu1tured ce11s stained positive1y for monoc1ona1 antibody pan cytokeratin by immunohistochemica1 method.ConclusionThe entire cornea1 tissue-cu1ture is a simp1e convenient and practicab1e method for cu1turing cornea1epithe1ia1ce11swhich cou1d be seria11y subcu1tivated.

cornea；epithe1ia1ce11s；ce11cu1ture techniques；rabbit

Q813.11

A

1007-3205（2011）10-1117-03

2011-07-09；

2011-09-03

王丹（1974-），女，遼寧昌圖人，中國醫科大學基礎醫學院醫學博士研究生，從事神經退行性相關疾病研究。

1*通訊作者。E-mai1：sungy2004@sohu.com

3*通訊作者。E-mai1：1uckzhuo1982@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.001