microRNA在骨骼肌發育中的功能及其表達的營養調控

黃志清 陳小玲 余 冰 毛湘冰 陳代文

(四川農業大學動物營養研究所，教育部動物抗病營養重點實驗室，雅安 625014)

microRNA(miRNA)是真核生物中一類約22 bp的非編碼RNA，近年來發現它是基因表達重要的調節因子。對miRNA功能研究和表達分析在不同物種間已經迅速展開，miRNA成為了當前生物學領域的研究熱點。研究證實，miRNA在肌肉發育和肌細胞增殖與分化中發揮了關鍵性的調控作用[1，2]，這為復雜的肌肉生物學研究注入了新的血液。miRNA的異常表達常見于包括骨骼肌肥大和肌萎縮等肌肉疾病中[3-4]，暗示miRNA在肌肉疾病中也扮演著重要的角色。近年來研究表明，營養也可以調控 miRNA的表達[5-6]，這對營養素作用的分子機制研究提供了新的思路。本文就miRNA在骨骼肌發育中的功能及其營養調控作一綜述。

1 miRNA的結構和作用機制

miRNA為一長約22個核苷酸的單鏈小分子RNA，由一段具有發夾結構長為70～80個核苷酸的前體 RNA(pre-miRNA)經 Dicer酶剪切后生成[7]，它廣泛存在于各種生物中。迄今，miRNA數據庫(http://www.mirbase.org)收錄了各種生物的miRNA共15 172條，其中人1 048條，小鼠672條，大鼠408條，豬211條，牛662條，綿羊4條，雞499條。各物種新的miRNA還在不斷地被克隆和發現。通過比較發現，多數miRNA在不同物種間高度保守。正是miRNA的這種廣泛存在和進化上的高度保守，暗示著它在生命活動中發揮著關鍵的調控作用。據預測，大約1/3的人類基因受miRNA的調控。

miRNA通過與其靶mRNA的3'非翻譯區(3'-UTR)互補配對，從而在轉錄后水平發揮基因表達調控功能[8]。miRNA調控基因表達的方式主要有靶mRNA的降解和靶mRNA在細胞質中的翻譯受阻這2種，前者導致靶mRNA數量減少而后者并不改變靶mRNA豐度。動物中絕大多數的miRNA與其靶mRNA形成不完全配對并通過翻譯受阻機制發揮作用[9]，但有些miRNA也可以在不完全配對的情況下介導靶mRNA的降解[10]。

2 骨骼肌miRNA在不同動物中的表達譜

miRNA的表達具有組織和發育階段特異性，不同的組織表達不同的miRNA，不同的發育階段有不同的miRNA表達。Cardinali等[11]通過比較處于增殖階段的成肌細胞和被分化成肌管的miRNA表達譜，發現miR-221和 miR-222在禽類和哺乳動物成肌細胞分化過程中顯著下調，并證實了miR-221和miR-222通過其靶基因——細胞周期抑制蛋白基因(p27)的表達來調控骨骼肌細胞的分化和成熟。McDaneld等[12]研究了胎豬(妊娠第60、90和105天)、新生仔豬和肥育豬骨骼肌組織以及豬骨骼肌衛星細胞中的miRNA表達豐度，結果表明，miR-206不存在于骨骼肌衛星細胞，但在其他時期表達豐富;miR-1在肥育期表達量最高，而在其他時期呈中等表達水平;miR-133在肥育期中等表達，而在胚胎期和新生仔豬中低表達;miR-432在妊娠第60天時表達水平最高，隨后逐漸下降;miR-24和miR-27在骨骼肌衛星細胞和肥育豬中表達量最高，而 miR-368、miR-376和miR-423-5p在新生仔豬中表達量最高。Zhou等[13]研究了妊娠第90天胎豬和120日齡豬背最長肌中miRNA表達譜，結果表明，妊娠第90天的胎豬中 miR-1826、miR-26a、miR-199b和 let-7的表達豐富，而 120日齡豬 中 miR-1a、miR-133a、miR-26a和miR-1826的表達豐富。

3 miRNA對骨骼肌發育的調控

骨骼肌肌生成需要許多事件相互配合，包括細胞退出細胞周期、肌肉特異性蛋白的表達、融合成多核的肌管、裝備成有收縮特性的肌纖維。miRNA被證實在骨骼肌發育和調控骨骼肌細胞增殖和分化方面發揮了關鍵性的作用。miR-1和miR-133是肌肉特異的2種miRNA，雖然它們位于染色體的相鄰位置且常同時表達，但在調控成肌細胞增值和分化過程中有著不同的功能。miR-1促進成肌細胞分化，抑制成肌細胞增殖，而miR-133則相反[14]。miR-206是另一個肌肉特異的miRNA，它通過下調DNA聚合酶α水平，導致DNA合成受抑制以及成肌細胞增殖停止，因而促進成肌細胞分化[15]。骨骼肌miRNA的表達常受肌細胞生成素(MyoD)家族和肌細胞增強子因子2(Mef2)等肌肉關鍵轉錄因子的調控[16，17]。有研究表明，miR-1和miR-133中含有這些轉錄因子的結合區域，如 Mef2和 MyoD能與 miR-1和miR-133結合，進而促進這些miRNA在骨骼肌中的特異性表達[18]。

出生后骨骼肌的正常發育和再生修復主要依賴于成體干細胞，即骨骼肌衛星細胞。配對盒基因7(Pax7)在骨骼肌衛星細胞存活、自我更新和增殖中發揮了重要作用。Chen等[19]研究衛星細胞由增殖向分化轉變過程中Pax7表達變化時，發現miR-1和miR-206在骨骼肌衛星細胞分化過程中顯著上調，通過熒光素酶報告基因分析實驗也證實了 Pax7是 miR-1和 miR-206的靶基因[19]。抑制miR-1和miR-206表達增強了骨骼肌衛星細胞的增殖和增加了Pax7蛋白水平，相反，持續表達Pax7降低了miR-1和miR-206的水平并顯著抑制了骨骼肌衛星細胞的分化[19]。這些結果揭示，miRNA與其靶基因間的相互作用，允許基因表達程序快速由增殖向分化轉變。

除肌肉特異的miRNA外，非肌肉特異表達的miRNA也參與了骨骼肌發育的調控。miR-181在小鼠成肌細胞系C2C12細胞分化過程中顯著上調[20]，提示miR-181可能參與成肌細胞分化的調節。進一步研究發現，miR-181通過下調其靶基因——同源異性盒家族(Hox-A11，一種成肌細胞分化阻遏物)基因的表達促進成肌細胞分化[20]。此外，miR-26a也被發現通過下調其靶基因——zeste基因增強子同源物基因(Ezh2)的表達促進成肌細胞分化[21]。miR-27b在分化的胚胎肌節和激活的骨骼肌衛星細胞中均有表達。研究發現，在骨骼肌衛星細胞中，miR-27b通過下調其靶基因——配對盒基因子(Pax3)的表達確保細胞正常進入成肌分化程序[22]。上述研究表明，肌肉特異的和非肌肉特異表達的miRNA在骨骼肌發育中發揮了重要的作用。

4 miRNA與骨骼肌疾病的關系

骨骼肌功能失調引發的主要疾病包括肌肉痿縮、肌肉肥大、炎性肌病和先天性肌病。這些疾病主要通過臨床和病理特征定義，但引起這些疾病的分子機制目前還不清楚。研究認為，骨骼肌疾病如肌肉痿縮可能與miRNA的表達異常有關。McCarthy等[23]研究了miRNA在小鼠骨骼肌中的表達情況，同時考察了小鼠后肢懸掛引起的肌肉痿縮能否改變這些miRNA的表達，結果發現，后肢懸掛2和7 d后，肌肉特異的miR-1、miR-133和miR-206的表達水平并未改變，而miR-499的表達水平顯著下調，并推測其機制可能是通過miR-499間接調控β-肌動蛋白重鏈的抑制子(Sox6)表達引起的。另有研究表明，miRNA與骨骼肌肥大存在直接的遺傳學聯系[24]。體內腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪引起小鼠骨骼肌肥大，采用實時熒光定量PCR技術檢測體內miRNA的表達變化，結果發現骨骼肌特異的miR-1和miR-133a的表達呈現顯著下調[25]，表明骨骼肌特異的miRNA可能對骨骼肌肥大也起著調控作用。由此可見，miRNA可作為骨骼肌疾病治療的潛在靶標。今后研究需進一步鑒定并挖掘參與發病的miRNA以及闡明這些miRNA在骨骼肌發病機制中的作用。

5 miRNA表達的營養調控

近年來研究表明，營養不僅可以調控骨骼肌發育關鍵基因的表達，還可以調控miRNA的表達[5，6]。肌肉生長抑制素(myostatin)是負調控骨骼肌生長發育關鍵的細胞因子。Drummond等[5]研究了由8種必需氨基酸混合劑對人骨骼肌中miRNA和myostatin等表達的影響，發現miR-499、miR-208b、miR-23a、miR-1 和 miR-206 的表達量顯著增加，而myostatin的表達量顯著下降[5]。除必需氨基酸外，也發現不飽和脂肪酸能夠調控miRNA的表達[6]。盡管目前關于營養調控miRNA表達的研究鮮有報道，但隨著國內外營養學領域研究者對miRNA的關注，miRNA也將成為營養學研究的熱點。

6 小結

與新miRNA的頻頻發現相比，miRNA的功能研究相對緩慢，目前只有一小部分miRNA的生物學功能得到闡明。盡管miRNA被發現參與了骨骼肌發育的調控，但其作用的分子機理目前還不完全清楚。營養被證實可以調控miRNA及其靶基因的表達，這將為更深層次詮釋營養素的作用機理提供新的研究方向。

[1]CALLIS T E，WANG D Z.Taking microRNAs to heart[J].Trends in Molecular Medicine，2008，14(3):254-260.

[2]VAN ROOI J，LIU E N，OLSON E N.MicroRNAs flex their muscles[J].Trends in Genetics，2008，24:159-166.

[3]EISENBERG I，ERAN A，NISHINO I，et al.Distinctive patterns of microRNA expression in primary muscular disorders[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104:17016-17021.

[4]EISENBERG I，ALEXANDER M S，KUNKEL L M.miRNAs in normal and diseased skeletal muscle[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2009，13(1):2-11.

[5]DRUMMOND M，GLYNN E L，FRY C S，et al.Essential amino acids increase microRNA-499，-208b，and-23a and downregulate myostatin and myocyte enhancer fator 2C mRNA expression in human skeletal muscle[J].Journal of Nutrition，2009，139(12):2279-2284.

[6]DAVIDSON L A，WANG N，SHAH M S，et al.n-3 Polyunsaturated fatty acids modulate carcinogendirected non-coding microRNA signatures in rat colon[J].Carcinogenesis，2009，30:2077-2084.

[7]BARTEL D P.MicroRNAs:genomies，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116(2):281-297.

[8]HOBERT O.miRNAs play a tune[J].Cell，2007，131:22-24.

[9]FILIPOWICZ W， BHATTACHARYYA S N，SONENBERG N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?[J].Nature Reviews Genetics，2008，9:102-114.

[10]ALVAREZ-GARCIA I，MISKA E A.MicroRNA functions in animal development and human disease[J].Development，2005，132:4653-4662.

[11]CARDINALI B，CASTELLANI L，FASANARO P，et al.MicroRNA-221 and microRNA-222 modulate differentiation and maturation of skeletal muscle cells[J].PLoS ONE，2009，4(10):1-13.

[12]MCDANELD T G，SMITH T P L，DOUMIT M E，et al.MicroRNA transcriptome profiles during swine skeletal muscle development[J].BMC Genomics，2009，10:77.

[13]ZHOU B，LIU H L，SHI F X，et al.MicroRNA expression profiles of porcine skeletal muscle[J].Animal Genetics，2010，41(5):499-508.

[14]CHEN J F，MANDEL E M，THOMSON J M，et a1.The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation[J].Nature Genetics，2006，38(2):228-233.

[15]KIM H K，LEE Y S，SIVAPRASAD U，et al.Mus-cle-specific microRNA miR-206 promotes muscle differentiation[J].Journal of Cell Biology，2006，174:677-687.

[16]ZHAO Y，SAMAL E，SRIVASTAVA D.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J].Nature，2005，436:214-220.

[17]RAO P K，KUMAR R M，FARKHONDEH M，et al.Myogenic factors that regulate expression of muscle-specific microRNAs[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A-merica，2006，103(23):8721-8726.

[18]LIU N，WILLIAMS A H，KIM Y，et al.An intragenic MEF2-dependent enhancer directs muscle-specific expression of microRNAs 1 and 133[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104(52):20844-20849.

[19]CHEN J F，TAO Y Z，DENG Z L，et al.MicroRNA-1 and microRNA-206 regulate skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by repressing Pax7[J].Journal of Cell Biology，2010，190(5):867-879.

[20]NAGUIBNEVA I， AMEYAR-ZAZOUA M，POLESSKAYA A，et al.The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-A11 during mammalian myoblast differentiation[J].Nature Cell Biology，2006，8(3):278-284.

[21]WONG C F，TELLAM R L.MicroRNA-26a targets the histone methyltransferase Enhancer of Zeste homolog 2 during myogenesis[J].Journal of Biological Chemistry，2008，283(15):9836-9843.

[22]CRIST C G，MONTARRAS D，PALLAFACCHINA G，et al.Muscle stem cell behavior is modified by microRNA-27 regulation of Pax3 expression[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106(32):13383-13387.

[23]MCCARTHY J J，ESSER K A，PETERSON C A，et al.Evidence of MyomiR network regulation of β-myosin heavy chain gene expression during skeletal muscle atrophy[J].Physiological Genomics，2009，39:219-226.

[24]CLOP A，MARCQ F，TAKEDA H，et a1.A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep[J].Nature Genetics，2006，38(7):813-818.

[25]MCCARTHY J J，ESSER K A.MicroRNA-1 and microRNA-133a expression are decreased during skeletal muscle hypertrophy[J].Journal of Applied Physiology，2007，102(1):306-313.