鮑曼不動桿菌分子流行病學研究進展

解放軍總醫院呼吸科 陳威震 陳良安

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鮑曼不動桿菌分子流行病學研究進展

解放軍總醫院呼吸科 陳威震 陳良安

介紹了鮑曼不動桿菌的分子流行病學特征，并比較了鮑曼不動桿菌幾種分子分型方法的優缺點。

鮑曼不動桿菌 分子流行病學 分子分型

流行病學的研究對象是某種疾病在特定人群中發生、傳播、預防、控制的影響因素，暴發性感染及其病原微生物的研究是流行病學研究的重要內容。分子流行病學是流行病學的重要領域，它的主要工作是通過追溯病原體來源，為判斷暴發性感染的范圍、撲滅疫情、制訂預防策略提供重要依據。上世紀80年代以來，DNA分子分型作為分子流行病學的重要技術迅猛發展，并為流行性感染的預防和控制提供了重要信息。

1 不動桿菌的分子流行病學

不動桿菌屬（Acinetobacter）是需氧、不發酵糖類的革蘭氏陰性桿菌，可分為6種：醋酸鈣不動桿菌（A. calcoaceticus）、魯菲不動桿菌（A. lwoffi）、鮑曼不動桿菌（A. baumanii）、溶血不動桿菌（A. haemolytius）、瓊氏不動桿菌（A. junii）和約翰遜不動桿菌（A. johnsonii）。

不動桿菌是機會致病菌，鮑曼不動桿菌、不動桿菌屬3型和13TU型是主要病原菌，常引起重癥監護病房患者的呼吸機相關性肺炎、皮膚和軟組織感染、創面感染、泌尿系統感染、繼發性腦膜炎和敗血癥[1]。鮑曼不動桿菌、不動桿菌屬3型和13TU型等臨床相關菌株與環境菌株醋酸鈣不動桿菌具有高度相似的生化和遺傳表型，在臨床診斷實驗室常難以區分，因而被統稱為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體（complex，Acb complex）[2]。不動桿菌屬3型、13TU型在臨床上相對少見，但這可能與VITEK等臨床常用菌種鑒定系統不能將其與鮑曼不動桿菌進行鑒別有關。醋酸鈣不動桿菌是環境菌株，而非臨床致病株；其他不動桿菌也少見于臨床樣本，一般認為毒性較低。約翰遜不動桿菌（A.johnsonii）、瓊氏不動桿菌（A.junii）、魯菲不動桿菌（A. lwoffii）等偶可引起散發醫院內感染，多與有創性置管治療有關且大多預后較好[3]。

與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等廣泛傳播病原菌的流行病學特征相似，鮑曼不動桿菌的流行病學特征包括：單克隆傳播傾向、常引起醫院獲得性感染、多具有多重耐藥特征。鮑曼不動桿菌常引起區域性暴發性院內感染[4-7]。其在醫院內傳播的主要途徑是：接觸被污染的醫療環境；接觸未做好安全防護的醫護人員。鮑曼不動桿菌感染的危險因素亦與其他多重耐藥病原菌相似[8]。宿主因素為：重大手術、包括燒傷在內的嚴重創傷、早產兒。暴露因素包括：居住重癥監護病房、住院時間、居住鮑曼不動桿菌曾經流行的病房、接觸被污染的醫療設備。治療相關因素包括：機械通氣；靜脈置管、尿路置管、體腔引流等置管相關治療；多次有創操作和抗生素治療史。

目前醫院暴發性感染常發生于重癥監護病房，而鮑曼不動桿菌是主要病原體，而重癥監護病房大量使用的抗生素起到了對多重耐藥菌株的選擇作用。近年來臨床分離鮑曼桿菌的多重耐藥率逐年穩步上升，且近年來碳青霉烯類抗生素的耐藥率也明顯提高，部分菌株甚至對多粘菌素、替佳環素等不常用或新開發抗生素也產生了明顯耐藥性[1, 9-11]。現有研究證明，鮑曼不動桿菌的多重耐藥菌株和抗生素敏感菌株在耐干燥和耐消毒劑、生物被膜、人類細胞黏附能力方面并無明顯區別，因而多重耐藥可能是流行克隆的主要特征[12-14]。

細菌克隆是指分離自不同時期不同地區，但具有相同的生物特征，因而可能來自同一祖先的菌株。在漫長的傳播過程中，同一細菌克隆可能衍生出具有細微生物特征差別的亞克隆。基于擴增片段長度多態性（AFLP）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）的分子分型技術研究結果都提示：與其他廣泛流行的病原菌類似，鮑曼不動桿菌在不同國家的暴發性流行都由有限的幾個克隆引發，而非大量克隆的同時播散[5-20]。基于細胞封套蛋白譜、核糖體分型和AFLP指紋的研究首次證實了歐洲1型和2型克隆的存在[4]。此后不久，歐洲3型克隆亦被報道[7]。目前已知以上3個克隆的流行區域不僅限于歐洲，而是在世界范圍內廣泛傳播，其流行區域也包括亞洲和中國[21]。

2 鮑曼不動桿菌的常見分型方法

1986年，Bouvet等建立了基于菌株生化表型的不動桿菌分類系統[22]。隨后，Gerner-Smidt等于1991年將該系統進行了進一步簡化，使其更加實用[2]。此后發展起來的多種基于遺傳表型的分型方法可更準確地對不動桿菌進行鑒定。目前為止，不動桿菌屬可分為33型，其中17型已得到正式命名。

目前可用于不動桿菌分子分型的技術有核糖體基因分型、AFLP、PFGE、MLST等，其中核糖體基因分型、AFLP、PCR/ESI-MS還能用于菌屬鑒定。現分述如下：

2.1 質粒分析。大部分不動桿菌都含有質粒，其中部分與耐藥性及耐重金屬殺滅作用有關[23-26]。質粒分析是最早應用于鮑曼不動桿菌分子分型的技術[27-29]，目前亦成功應用于其他不動桿菌的分子分型[30-32]。但該技術的缺陷也很明顯：質粒易于在菌株之間傳遞，因而該分型方法的可靠性有限。

2.2 核糖體基因分型。核糖體基因分型可用于不動桿菌菌屬鑒定，尤其是醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體的菌屬鑒定[33-35]。早先使用EcoRI、ClaI、SalI等限制性內切酶的核糖體分型技術操作繁瑣，且精確度低于PFGE[36, 37]。后來開發的使用HindIII/HincII等限制性內切酶的核糖體分型技術，其精確度已與AFLP相當。近來出現的自動核糖體基因分型儀的精確度類似于PFGE且耗時少；但自動技術花費較大，只有少數研究機構才有能力購置[37-39]。

2.3 脈沖場凝膠電泳。PFGE目前仍是大部分菌屬的標準分子分型技術，小樣本的研究也顯示PFGE和AFLP的精確度相似[7, 37]；但該方法操作繁瑣且耗時較長，無法大量推廣。

2.4 AFLP。可同時應用于不動桿菌的菌屬鑒定和分子分型[4, 40, 41]。AFLP目前已成功應用于鮑曼不動桿菌暴發性感染的分子流行病學研究[7, 15, 16, 42]，并最早推斷出歐洲I、II、III型3個流行克隆的存在[7, 34, 43]。2000年，Leiden大學醫學中心建立了包括2000多株菌株的AFLP數據庫，為AFLP的進一步推廣打下了基礎。但該方法對技術的要求較高，在分析條帶型時也需要大量的經驗，因而只適用于少數大型研究機構。此外該方法的一個重要缺陷是重復性受外界因素的影響較大，不同實驗室之間的研究結果無法比較。

2.5 MLST。MLST是一種通過對多個管家基因的部分DNA序列測序來發現菌株變異的分型方法。MLST一般測定7個管家基因內部的部分DNA序列，根據每一序列的序列特異性賦予一個特定的等位基因編號，每一菌株7個管家基因的7個特異性編號即構成該菌株的序列型（sequence type，ST）。MLST的分辨力接近于PFGE和AFLP，并已成功應用于多種菌屬[44-47]，但花費較大且操作繁瑣，不適用于鮑曼不動桿菌暴發性感染的臨床檢測。該方法的明顯優勢在于可比較不同來源菌株的親緣關系并用于分子流行病學的研究。目前已有多種MLST分型技術應用于鮑曼不動桿菌的研究[48-51]，但這些技術因為未能結合鮑曼不動桿菌特有的遺傳結構，因而仍然無法揭示流行克隆的內在遺傳特征。

2.6 PCR/ESI-MS。可用于不動桿菌的菌屬鑒定，也可將鮑曼不動桿菌、不動桿菌3型、13Tu型區別開來[48]。該方法的優點是實驗時間短，4小時即可。但其可靠性還有待進一步分析。

綜上所述，質粒分析分型可靠性差，核糖體基因分型分辨率較低；而AFLP、PFGE等指紋分型技術只能提供有限的遺傳進化信息、各實驗室使用的操作規程及閾值存在差異、實驗室之間的結果無法比較、無法排除菌株亞型的干擾，因而在分子流行病方面的應用有限。現有的多種鮑曼不動桿菌MLST分型技術亦無法揭示流行克隆的遺傳特征。

3 基于最小生成樹分析的MLST分型技術

目前已知發生于世界不同地區的鮑曼不動桿菌暴發性感染與都與歐洲1型、2型和3型克隆有關，但對其他不動桿菌的遺傳差異及進化相關性卻知之甚少。2010年4月，法國巴斯德研究所為主導的多個團隊，共同建立了一個鮑曼不動桿菌MLST分型系統，試圖解決這一難題[52]。該研究搜集了遺傳背景盡可能多樣化的不動桿菌屬菌株作為研究對象，其中最主要的是123株AFLP指紋譜完全不同的臨床分離菌株（含48株醫院暴發性感染相關菌株）。此外還包括15株與鮑曼不動桿菌遺傳表型高度相似的不動桿菌屬3型、13TU型、醋酸鈣不動桿菌和4株其他不動桿菌屬菌株。

基于最小生成樹分析（Minimum spanning tree analysis）的MLST分型系統的分析表明：鮑曼不動桿菌的進化與其他廣泛播散的感染性病原菌的樹形進化不同，表現為菌株之間遺傳差異相對較小的星形進化，這可能與鮑曼不動桿菌近期進化過程中曾經存在一個比較嚴重的進化瓶頸有關。同時，鮑曼不動桿菌與醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體其他菌株，也并非如此前所知的那樣具有高度的遺傳表型相似性，而是存在較明顯的遺傳差異。目前該MLST系統已可成功地對歐洲1型、2型和3型三個已知流行克隆進行鑒定，并可用于描述鮑曼不動桿菌菌株之間的親緣關系。

這一MLST分型系統目前報道了5個克隆復合體，其中克隆復合體1、2和3分別對應歐洲1、2和3型克隆[52]。1型克隆復合體又包含了1、7、8、19和20型共5個序列型。其中序列7、8、19和20型相互之間各存在2個核苷酸的序列差異，但與序列1型卻都僅有一個核苷酸的序列差異，因而序列1型被認為是1型克隆復合體的遺傳起源，而其他各序列型都是由序列1型進化而來。2型克隆復合體包含2、45和47共3個序列型。序列45和47型與序列2型在管家基因fusA上存在序列差異，因而序列2型是2型克隆復合體的遺傳起源。3型克隆復合體則包含序列3和14型。

AFLP、PFGE等分型技術目前已廣泛應用于多種病原菌的分子流行學研究[15-20]，但這些指紋譜分型技術提供的遺傳信息過于龐雜，無法排除流行克隆菌株在播散過程中產生的克隆亞型的干擾，因而提供的信息有限。該研究表明：這一MLST分型系統與AFLP相似性80%為分型界值的敏感性相似，而較相似性90%為界值的AFLP分型方法敏感性更低[52]。因而該分型方法在準確鑒定鮑曼不動桿菌克隆特異性的同時，還可避免遺傳指紋譜分型方法因敏感性過高而將克隆亞型錯誤鑒定為克隆型的缺陷。

綜上所述，分子流行病學的主要研究內容是鑒定不同暴發性感染的病原菌是否來自同一克隆，分子分型技術可用于追溯不同醫院、不同城市、不同國家、甚至不同大陸暴發性感染的來源，包括MLST在內的新型分子分型技術的出現，將為研究多重耐藥鮑曼不動桿菌的流行機制提供重要的依據。

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