激光捕獲顯微切割技術在胃腸道腫瘤研究中的應用

邢 敬* 綜述 陳曉宇 審校

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科 上海市消化疾病研究所（200001）

人體組織是由多種細胞組成的復雜結構，實體瘤組織如胃腸道腫瘤不僅包含腫瘤細胞（實質成分），還包含其他多種類型的細胞和基質（間質成分），如各種炎性細胞、纖維結締組織等，因此通過直接研磨組織塊提取DNA、RNA、蛋白質等進行研究并不能確切反映腫瘤的生物學特性。隨著分子生物學研究的進展而出現的芯片技術、腫瘤基因組學、蛋白質組學等高通量分析均需獲取單一純凈的細胞。雖然細胞培養可解決組織異質性問題，但體外培養的細胞脫離了體內環境，缺乏細胞間的相互作用和神經內分泌調節，不能完全反映細胞在體內的真實情況。此外，體外培養的腫瘤細胞株多源自中晚期癌細胞，無法反映腫瘤發生早期的分子生物學特點。

激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection,LCM）技術是一種在顯微鏡直視下，通過激光捕獲和切割從異質性組織中獲得純凈目的細胞群或單個細胞的技術[1]。LCM系統最早于1996年由美國國立癌癥研究所的Emmert-Buck等設計開發，并于次年實現商品化。該技術既解決了組織異質性問題，又不脫離體內環境，很好地滿足了研究的需要，是連接病理學研究與分子生物學研究不可或缺的橋梁。迄今為止，LCM結合 PCR、RT-PCR、實時熒光定量 PCR、二維電泳（2-DE）、蛋白質印跡法、質譜法等多種技術，已在乳腺、前列腺、胃、結直腸等多種組織器官的研究中得到廣泛應用。目前使用的LCM系統主要包括 Arcturus PixCell IIe、Zeiss PALM MicroBeam和Leica AS LMD三種，三者各有其優缺點。我國是胃癌高發地區，近年來結直腸癌的發病率亦逐漸升高。為此，本文對LCM的操作步驟及其與多種技術結合，在胃腸道腫瘤研究中的應用作一綜述。

一、LCM的操作步驟

1.標本的制備和保存

冰凍組織的制備和保存：手術切除或活檢標本獲得后立即以OCT冰凍切片包埋劑包埋，液氮冷凍，-80℃冰箱干燥保存備用。如不預先包埋，后續切片時仍需行OCT包埋，筆者等在工作實踐中發現這樣可能會因組織凍融而影響研究結果。

石蠟包埋組織的制備和保存：所取組織塊三個維度均不宜大于5 mm。以醛類為基礎的固定劑，如甲醛溶液（福爾馬林溶液）屬于交聯固定劑，可引起RNA降解，適用于DNA的分析，不適用于RNA和蛋白質的分析；以醇類為基礎的固定劑，如Methacarn液屬于蛋白沉淀固定劑，適用于RNA和蛋白質的分析。從石蠟包埋組織中提取得到的活性分子，數量和質量一般均低于冰凍組織[2]。由于常規病理標本多為甲醛固定石蠟包埋（FFPE）保存，有學者嘗試從FFPE組織中提取RNA和蛋白質行基因芯片或定量蛋白質組學研究，結果顯示可行[3,4]，其方法學仍有待進一步探討。

2.切片的制備

冰凍切片的制備：冰凍切片機預先以75%乙醇擦拭、晾干，切片厚度以5～10μm為宜，不宜過厚。其中第一張切片行HE染色，用于病理診斷和顯微切割時的對照（如包含目的細胞），明確切片上包含目的細胞后方可繼續切片并固定于適當的載玻片上。如不立即行后續操作，切片可-80℃保存備用。

石蠟切片的制備：連續切片，厚度以10μm為宜。其中一張切片行HE染色用于病理診斷和顯微切割時的對照，其余根據所使用的LCM系統固定于適當的載玻片上，常溫保存備用。

3.切片的染色：用于RNA和蛋白質分析的冰凍切片染色前需預先在70%乙醇中固定0.5～1 min。用于辨別顯微切割目的細胞的染色方法多樣，包括甲基綠、甲苯胺藍、蘇木精、HE、AB-PAS、免疫組化染色等，可根據需要選用。然而在染色過程中，細胞中的RNA或蛋白質可能會被破壞，從而影響后續實驗結果。有研究[5]探討了不同染色方法對冰凍切片中小鼠漿細胞瘤細胞RNA的影響，發現甲基綠染色對RNA的影響最小，其次為HE染色和免疫熒光染色，Nissl染色影響最大。單獨蘇木精染色對蛋白質的影響較小[6]。筆者等曾嘗試對冰凍切片行快速HE染色，顯微切割后提取DNA、RNA和蛋白質進行研究，取得良好效果。

4.目的細胞的切割：各類LCM系統的組成大致包括顯微鏡、固態近紅外激光二極管、激光控制器、控制顯微鏡載物臺的操縱桿、CCD照相機、彩色監視器等。顯微鏡通常與個人電腦連接，用于激光的控制和圖像的保存。首先將切片置于顯微鏡載物臺上。以Arcturus PixCell IIe LCM系統為例，操作需在顯微鏡直視下進行，根據形態學或免疫組化染色選擇目的細胞，以裝有乙烯乙酸乙烯（EVA）聚合物膜的塑料轉移帽覆蓋欲切割的區域，按下按鈕發射近紅外激光脈沖，瞬間使目的細胞上不耐熱的EVA膜融化并與目的細胞結合，移動操縱桿，將目的細胞從異質性組織中切割下來。每張切片的總捕獲時間以不超過40 min為宜。Zeiss PALM MicroBeam LCM系統是以激光脈沖將目的細胞彈射進收集管中。Leica AS LMD LCM系統是以紫外激光脈沖將帶有目的細胞的聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜切割下來，膜受重力作用落入收集管中。筆者等在使用Leica AS LMD LCM系統的過程中發現，由于靜電吸引和空氣擾動，切下的膜可能會吸附在切片背面或飄至別處，因此在切割時應注意防止這些因素的干擾。細胞收集完成后即可根據需要進行后續實驗。如不立即進行后續實驗，可將所收集的細胞置于EP管中，-80℃保存備用。有研究[7]顯示，使用LCM系統（Arcturus PixCell）獲得的胃癌細胞純度如達到70%，其基因表達譜檢測結果與非顯微切割標本相比可存在明顯差異，表明通過LCM技術獲取純凈細胞進行研究，結果更為準確可信。

二、LCM結合多種技術在胃腸道腫瘤研究中的應用

1.DNA的分析：腸型胃癌的發生是一個多階段、多步驟的過程，然而胃癌前病變的克隆狀態及其與細胞增殖動力學的關系仍未完全闡明。Wang等[8]使用Arcturus Lcc1704 Veritas LCM系統，根據HE染色結果從FFPE組織中分離病變和正常胃黏膜上皮細胞，行人雄激素受體基因PCR以分析其克隆形成能力，結果顯示單克隆起源率隨腸化生、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變至腸型胃癌的多階段癌變進程而逐級增高（16%、22%、69%和100%），在一定程度上與Ki-67的表達率相關，提示克隆狀態的檢測可能用于評估胃癌易感性。

目前認為大多數胃腸道間質瘤（GISTs）存在 c-kit或PDGFRA基因激活突變，兩者突變在GIST發生早期其起源細胞Cajal間質細胞（ICCs）向腫瘤細胞轉化的過程中起重要作用。Nakajima等[9]使用Arcturus PixCell II LCM系統，根據KIT免疫組化染色結果獲得10例散發性GIST患者FFPE組織中GIST鄰近區域的ICCs，通過PCR和直接DNA測序檢測了兩種基因的突變情況，發現無一例患者存在這兩種基因突變，提示除c-kit和PDGFRA基因突變外，GIST的發生還可能與其他分子事件有關。

結直腸癌的發生除經典腺瘤-腺癌途徑外，尚有de novo途徑和鋸齒狀途徑。研究發現BRAF基因突變與結直腸鋸齒狀病變顯著相關，非鋸齒狀病變中該基因突變罕見，而KRAS基因突變主要與非鋸齒狀增生性息肉相關。增生性異型隱窩灶（ACF）是公認的結腸癌前病變，Rosenberg等[10]使用Veritas LCM系統從冰凍切片中分離ACF細胞，通過直接PCR測序檢測了55個ACF樣本中兩種基因的突變情況，發現鋸齒狀與非鋸齒狀增生性ACF的BRAF突變率分別為63%和3%，組間差異有統計學意義，兩組間KRAS突變率無明顯差異（19%對42%），表明BRAF基因突變與鋸齒狀增生性ACF顯著相關，該病變是結直腸癌鋸齒狀發生途徑中的早期或可能的起始步驟。

微衛星不穩定（MSI）和雜合性缺失（LOH）與腫瘤的發生、發展相關。Roa等[11]使用Arcturus PixCell I LCM系統，根據甲基綠染色結果從94例胃癌活檢標本石蠟包埋組織中的淋巴細胞（對照）、腸化生和胃癌區域獲得相應細胞群，通過放射性標記PCR檢測MSI和LOH發生情況，發現83%的胃癌和54%的腸化生中存在LOH，高級別MSI（MSIH）存在于11.7%的胃癌和17%與MSI-H表型胃癌相關的腸化生中，表明腸化生在遺傳學上具有高度不穩定性。為驗證MSI在胃黏膜腸化生上皮中頻發的假說，Garay等[12]于胃癌高危地區收集了58例非胃癌腸化生（包括完全性和不完全性腸化生）個體的活檢標本，使用Arcturus PixCell LCM系統，根據HE染色結果從乙醇固定石蠟包埋組織中取得化生上皮細胞，通過放射性標記PCR行MSI分析，結果顯示無一例個體存在MSI，表明MSI在非胃癌個體的腸化生上皮中屬罕發事件。

2.RNA的分析：RNA為基因表達產物，通過LCM技術獲得純凈細胞行RNA分析能更準確地反映基因表達情況。既往觀點認為轉錄因子RUNX3是胃抑癌基因編碼產物。Friedrich等[13]聯合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系統，FFPE組織切片，HE染色）和定量RT-PCR，發現胃黏膜上皮中RUNX3 mRNA表達水平極低，且不受腫瘤轉化和幽門螺桿菌（H.pylori）感染的影響，胃間質中RUNX3 mRNA呈高表達，表達水平與H.pylori誘導的胃炎程度相關。鑒于RUNX3在胃黏膜上皮中低表達且在胃癌中未見表達下調，不支持RUNX3為胃抑癌基因的假說。

類肝素酶與腫瘤侵襲和血管生成相關。Wang等[14]的研究發現，如以常規組織標本行RT-PCR，所有胃癌原發灶、轉移淋巴結和幾乎所有配對正常胃黏膜組織中均可檢測到類肝素酶轉錄水平的表達；如聯合使用LCM（Arcturus LM200 LCM系統，冰凍切片，HE染色）和 RT-PCR，原發灶胃癌細胞和淋巴結轉移細胞的類肝素酶表達率分別為47%和95%，配對正常胃黏膜上皮細胞中則無類肝素酶表達，原發灶胃癌細胞中的類肝素酶表達與腫瘤侵襲（Borrmann分型、胃壁浸潤深度）和淋巴播散范圍密切相關。該研究結果表明聯合使用LCM與RT-PCR是進行分子水平分析的可靠方法。

目前關于胃腸道腫瘤遺傳學改變的全面、準確的信息欠缺。Wu等[15]采用LCM（Arturus PixCell II LCM系統，冰凍切片，HistoGeneTMLCM Frozen Section Staining Kit染色）結合RNA線性擴增和cDNA微陣列技術檢測胃癌基因表達譜，鑒定出504個能區分胃癌與非胃癌的基因，準確性高于99%。Wang等[16]采用LCM（Leica LCM系統，冰凍切片，甲苯胺藍染色）結合cDNA微陣列技術比較正常胃組織、胃癌原發灶與轉移淋巴結的差異基因表達譜，發現了四個在胃癌發生和轉移中起關鍵作用的基因，其中OPCML、RNASE1、YES1的表達模式類似抑癌基因（原發灶中表達較正常組織下調，轉移淋巴結中進一步下調），ACK1的表達模式類似原癌基因。后續以結腸癌為對象的研究證實上述基因在結腸癌中的表達模式與在胃癌中相同[17]，提示這些基因可能作為腫瘤侵襲、進展的生物學標記。

3.蛋白質的分析：通過LCM技術獲得純凈細胞，結合2-DE、蛋白質印跡法、質譜法等技術的研究是尋找有價值的腫瘤蛋白質標記的重要途徑。Zhang等[18]采用比較蛋白質組學方法，聯合LCM（Leica LCM系統，冰凍切片，甲基綠染色）與SDS-PAGE、18O標記、nano-HPLC-MS/MS技術鑒別胃癌的生物學標記，發現與配對非癌胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞中有42種蛋白表達上調，36種蛋白表達下調。 Cheng等[19]聯合使用導航 LCM（Arcturus PixCellα LCM系統，冰凍切片，蘇木精染色）與2-DE技術，對惡性與非惡性胃賁門上皮細胞進行了比較蛋白質組學研究，結果顯示癌細胞中有15種蛋白表達上調，8種蛋白表達下調，其功能涉及代謝、分子伴侶、抗氧化、信號轉導、細胞凋亡、細胞增殖和分化。上述發現有助于闡明胃癌發生的分子機制，并為胃癌的早期診斷和治療提供可能的臨床生物學標記和治療靶點。

90%的結直腸癌死亡病例與原發腫瘤的轉移擴散有關。Lin等[20]采用定量蛋白質組學方法，聯合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系統，冰凍切片，核固紅染色）與2-DE技術從980個蛋白中鑒別與結直腸癌淋巴結轉移相關的分子標記，結果顯示肌動蛋白結合蛋白transgelin是預測淋巴結轉移的最佳候選生物學標記，ROC曲線下面積為0.868（P=0.002）。

確定腫瘤細胞的蛋白質信號通路激活狀態，是進行腫瘤個體化生物靶向治療時患者選擇和分層的基礎。Silvestri等[21]結合LCM（Arcturus Pixcell II系統，冰凍切片，HE染色）和反相蛋白質微陣列技術比較了結直腸癌標本癌細胞與腫瘤間質細胞中75種已知參與了腫瘤進展的蛋白質的磷酸化情況及其表達水平，發現兩種細胞的蛋白質激活特征存在顯著差異；非顯微切割全組織樣本與配對LCM樣本相比，測得的蛋白質信號激活譜明顯不同。該結果表明LCM技術對獲取足量腫瘤細胞行蛋白質信號通路激活特征的檢測具有重要意義。

三、展望

LCM技術于顯微鏡直視下獲取純凈目的細胞，解決了組織異質性問題，與手工切割相比準確、方便、快捷，大大提高了后續研究的準確性，對于研究胃腸道腫瘤的發生、發展機制以及尋找新的診斷和治療靶點具有重要意義。然而，目前LCM技術仍存在一些缺點和問題有待改進，如蠟塊保存的組織易發生降解，從中提取RNA、蛋白質進行分析有一定難度，相關試劑盒有待開發；染色效果不盡理想，需具備豐富的病理學知識才能準確辨別目的細胞，且單純根據形態學特征無法區分不同細胞亞型，需進一步開發辨別目的細胞的快速免疫組化和免疫熒光技術；獲得的細胞總量較少，行蛋白質組學研究較為困難，需解決如何利用盡量少的細胞甚至單個細胞進行后續研究的問題。此外，筆者等在工作實踐中發現顯微切割足量的目的細胞需耗費大量時間和精力，亦給LCM技術的廣泛應用帶來很大阻礙。近年導航LCM、自動LCM等新技術陸續出現，從蠟塊中提取生物大分子的試劑盒的研究以及通過免疫組化、免疫熒光技術辨別目的細胞的方法亦已取得一定進展。相信隨著技術的進步，LCM作為一項具有獨特優勢的技術與其他多種技術相結合，將在胃腸道腫瘤和腫瘤學以及其他多個學科的研究中發揮更大作用。

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