粒細胞集落刺激因子在大腸桿菌中表達的研究進展*

何 磊，于鳳波，王永峰，杭太俊

(1.中國藥科大學，南京 210009； 2.天津天士力研究院，天津 300410)

1 粒細胞集落刺激因子概述

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factors, G-CSF)是存在于正常人體、刺激骨髓細胞集落形成的集落刺激因子的一種，能夠在體內外特異地作用于中性粒細胞系,促進其增殖、分化,并能維持功能和存活的一種糖蛋白類生長因子[1]。

早在1986年,由Nagata等從人鱗狀細胞癌細胞系CHU-II中分離了hG-CSF基因,首次確定了其核苷酸序列并在COS細胞中表達。hG-CSF是一種單核細胞、成纖維細胞及內皮細胞產生的由174個氨基酸殘基組成的含30種信號肽的糖蛋白,分子量為19. 6 kDa，PI為6.1，O-糖基化對酸堿(pH 2～10)、熱以及變性劑等相對較穩定。hG-CSF有5個半胱氨酸殘基,其中4個半胱氨酸殘基在Cys 36與Cys 42, Cys 74與Cys 64之間形成兩對二硫鍵;Cys 17為不配對半胱氨酸,二硫鍵對于維持G-CSF生物學功能是必須的因素[2]。

2 粒細胞集落刺激因子臨床應用

G-CSF在臨床上應用十分廣泛，骨髓移植時可促進中性白細胞的恢復；改善再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥；明顯改善癌癥化療時引起的嚴重的中性粒細胞缺乏,加大腫瘤治療的力度,增強治療效果；廣泛應用于其他伴有中性粒細胞減少的疾病及抗感染等的治療。G-CSF天然產物來源非常有限,遠遠不能滿足臨床上的需要。而基因工程的重組G-CSF的生物學活性與天然的相似，且可大規模生產,利用DNA重組技術生產可供臨床應用的人重組G-CSF的方法已被廣泛應用[3，4]。

3 粒細胞集落刺激因子在大腸桿菌中的表達研究

早在1985年,Welte K成功地從人膀胱癌細胞株5637的培養上清液中純化并精制出hG-CSF,然后Welte K與美國的AMGEN公司的Souza L M又進一步確定這種hG-CSF的N段氨基酸排列順序,將來源于5637細胞株的hG-CSF基因克隆化,采用基因工程技術將該基因插入大腸桿菌成功地制得hG-CSF而開發出重組人粒細胞集落刺激rhG-CSF,商品名為Filgratin(惠爾血)。該藥1991年美國FDA批準上市[5]。

我國科研工作者也成功構建多個重組G-CSF工程菌種,利用原核表達體系實現高表達。葛永紅等[6]采用RT-PCR技術從LPS誘導的人外周血單核細胞中擴增出人粒細胞集落刺激因子cDNA,將編碼成熟序列的cDNA在保證編碼氨基酸不變前提下突變并插入到PR啟動子下游,使rhG-CSF在大腸桿菌中獲得表達。表達產物為包涵體,占菌體總蛋白量的21.4%。2008年,傅一鳴等采用PCR方法,成功構建了C末端融合有一種能特異結合人抗體Fc段的小肽的新型rhG-CSF融合蛋白(rhG-CSF-tag1)表達載體,實現了其在大腸桿菌中的高效表達、復性和純化。亦有人采用優化密碼子的方法成功實現了高表達,以及進行修飾cDNA 序列后提高表達的成功先例[7-8]。目前已有長效PEG化的rhG-CSF成功的報道。張兵等[9]經大腸桿菌溫度誘導表達得到包涵體,經過變性、復性和分離純化等步驟處理后得到純化的rhG-CSF。用單甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)對rhG-CSF進行化學修飾,盡管修飾后的rhG-CSF體外生物學活性下降至修飾前的20%左右,但其在體內的作用時間能夠得到顯著的延長,藥效有了明顯提高。

從制備工藝和G-CSF的構效關系角度考慮,采用原核表達體系(主要是大腸桿菌表達體系)具有遺傳背景清楚、細胞生長迅速、發酵周期短、易于篩選和基因重組操作、表達系統較為豐富等優點。但是原核表達體系也存在一些缺點，如外源蛋白無法糖基化和易于形成包涵體等。G-CSF具有糖基化與否并不影響其活性的特點,而外源蛋白形成的包涵體必須經過變性、再折疊復性,才能得到活性蛋白產物。但上述表達G-CSF方法都形成包涵體,必然存在操作過程煩瑣、復性效率低等問題。原核表達體系如能夠實現外源蛋白的胞內可溶表達或周質腔分泌表達,在實踐應用中將會大大提高工作效率,節約生產成本[10]。

人們曾采取多種方式促進外源蛋白的可溶表達。與葡萄球菌蛋白A (SPA)[11]、谷胱甘肽(GST)[12]或硫氧環蛋白(thioredoxin)[13]融合表達,對部分外源蛋白能夠起到促可溶作用；利用蛋白質二硫鍵形成相關蛋白[14,15]、脯氨酰順反異構酶[16]和其他分子伴侶的輔助折疊作用,設計表達載體,能夠明顯促進外源蛋白的胞內可溶表達。但是,胞內可溶表達方式也具有比較明顯的缺點，如胞內屬還原性環境,不利于外源蛋白形成正確的二硫鍵橋,進而影響正確構像的形成[17]；需要超聲破碎或壓力破碎細胞壁才能釋放胞內可溶表達組分,不利于大規模培養和純化。

比較而言,因為周質腔屬氧化型環境[17], 可以模擬真核細胞的內質網環境,有利于形成正確的二硫鍵橋,獲得具有完全生物學活性的重組蛋白，而且提取周質腔表達組分時不需要破碎細胞壁,能夠大幅度降低純化成本,所以周質腔分泌型表達是一種理想的表達方式[17]。

通常將外源蛋白與適當的信號肽融合,借助信號肽的引導作用將外源蛋白分泌到周質腔中。在所有分泌到大腸桿菌周質中的蛋白質中均發現了信號序列,信號序列對于在大腸桿菌中分泌蛋白質是必要的。利用大腸桿菌系統,在外源基因的N端融合一段細菌蛋白的疏水信號肽(OmpA、OmpF、PeIB、PhoA、SpA等，就其本身或有稍微的修飾),可將目的蛋白運送到周質空間(translocation)。蛋白跨內膜后由細菌的信號肽酶將信號肽切除,獲得具有天然一級結構(不含N端多余的甲硫氨酸)的產物。控制表達載體的拷貝數,選擇合適的啟動子和培養基,采用適當誘導表達方式和培養條件(培養溫度、誘導時機和誘導時間),會改善周質腔分泌型表達的效率[18]。Perez-Perez等[19]嘗試得到分泌形式的hG-CSF,使用大腸桿菌信號序列之一的OmpA,沒有成功。但為了解決該問題,他們使用兩種分子侶伴蛋白DnaK和DnaJ的共表達系統,僅僅得到少量分泌的hG-CSF。另外,Chung等[20]用另一種信號序列Pe1B試圖得到分泌形式的hG-CSF,同樣沒有成功,但hG-CSF以不溶性包涵體的形式在胞質中積累。王富強等[21]構建了含有金黃色葡萄球菌蛋白A的信號肽序列的hG-CSF基因,導入到大腸桿菌融合分泌表達載體pSEGF中,將hG-CSF融合蛋白直接分泌到培養基中。雖表達產物具有很好的可溶性,不會聚集形成包涵體,但和胞內表達相比,表達量較低仍然是該技術的問題。1998年,金磊[22]在構建重組質粒時加入信號肽和Trp啟動子,導入大腸桿菌K12菌種中,控制發酵溫度,得到分泌蛋白,收率達35%左右。

大腸桿菌分泌蛋白二硫鍵的形成是一系列蛋白協同作用的結果,主要是Dsb家族蛋白,迄今為止共發現了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在體內,DsbA負責氧化兩個巰基形成二硫鍵,DsbC和DsbG則負責校正DsbA導入的異常二硫鍵。除了直接和二硫鍵的形成相關外,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侶功能。該分子伴侶功能獨立于二硫鍵形成酶的活性并且對二硫鍵形成酶活性具有明顯的促進作用。

Carlos等[23]運用λPL啟動子,在其他實驗條件，如培養基的組成、誘導時機、表達條件、宿主細胞(大腸桿菌W3110或RB791)等相同的情況下, 利用DsbA、npr、STII，以及一種從天然生長激素中提取的信號蛋白序列(作為對照)等4種不同的信號肽,將目的蛋白分泌到大腸桿菌周質腔，通過研究發現,以DsbA作為信號肽序列的重組hGH基因在大腸桿菌W3110或RB791周質腔中得到了最高的表達量,分泌表達蛋白占總蛋白的80%。利用DsbA蛋白作為信號肽,在實現G-CSF突變體周間腔水平的分泌表達,得到活性蛋白的生產工藝將會得到長足的發展。

1 Nafar M,Parvin M,Sadeghi P,etal.Effects of stem cells and granulocyte colony stimulating factor in reperfusion injury.Iran J Kidney Dis,2010,4(3):207

2 Hill C P,Osslund T D,Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulating factor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(11):5167

3 張學軍,孔南遷.重組人粒細胞集落刺激因子在惡性腫瘤化療后應用的療效觀察.中國藥房,2010,21(8):713

4 龍女,張巧花,侯淑玲.重組人粒細胞集落刺激因子的臨床應用現狀. 中國藥物與臨床,2010,10(6):676

5 于景敏,孟志云,竇桂芳.粒細胞集落刺激因子的研究新進展. 中國實驗血液學雜志, 2008,16(2):452

6 葛永紅,儲淳,劉國榮,等.重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大腸桿菌中的表達及鑒定.中國生物制品學雜志,1998,11(2):68

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8 Bo-Hye Nam,Geun-Hee An,Gun-Wook Baeck,etal.Molecular cloning and expression of cDNAs for two distinct granulocyte colony stimulating factor genes from black rockfish Sebastes schlegelii.Fish & Shellfish Immunology,2009,27(2):360

9 張兵,鄒文藝,戎隆富,等. 重組人粒細胞集落刺激因子的表達、純化以及PEG修飾. 生物學雜志,2008,25(2):36

10 羅惠霞,李敏,王玉炯.Reteplase(K)原核分泌表達載體的構建及其初步表達.生物學雜志,2010,27(5):7

11 李愛華,唐濤,張惠媛,等.細菌磁小體的修飾及其在病原物檢測中的應用.生物物理學報,2010,26(8):680

12 蔡學敏,趙娜,左大明,等.人MASP1 N端片段原核表達載體的構建及其表達. 細胞與分子免疫學雜志, 2008,24(6):546

13 汪洋,馬明浩,馮震,等.重組人谷氨酸脫羧酶65的表達及活性研究.中國生物工程雜志,2009,29(4):12

14 Yoichi Kurokawa,Hideki Yanagi, Takashi Yura,etal.Overexpression of protein disulfide isomerase DsbC stabilizes multiple-disulfide-bonded recombinant protein produced and transported to the periplasm in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol,2000,66(9):3960

15 Zhang Z,Huang H L.Escherichia coli disulfide-forming related proteins:structures,functions and their application in gene engineering for expressing heterologous proteins in Escherichia coli.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2002,18(3):261

16 彭金彪,韓宏曉,洪 煬,等.日本血吸蟲 Sj CyclophilinA 基因的克隆、表達及其生物學功能研究.中國農業科學,2010,43(7):1531

17 王驪麗,耿信篤.源于大腸桿菌蛋白的表達、液相色譜復性與純化新進展.中國科學,2009,39(8):711

18 Mergulhao F J,Monteiro G A,Larsson G,etal.Evaluation of inducible promoters on the secretion of a ZZ-proinsulin fusion protein in Escherichia coli.Biotechnol Appl Biochem,2003,38(1):87

19 Perez-Perez J,Martinez-Caja C,Barbero J L,etal.DnaK/DnaJ supplementation improves the periplasmic production of human granulocyte-colony stimulating factor in Escherichia coli.Biochem Biophys Res Commun,1995,210(2):524

20 Bong Hyun Chung,Mi-Jin Sohn,Su-Wan Oh,etal.Overproduction of human granulocyte-colony stimulating factor fused to the pelB signal peptide in Escherichia coli.Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998,85(4):443

21 王富強,周興軍,王彥芳,等.hG-CSF大腸桿菌分泌表達系統的構建.Pharmaceutical Biotechnology,2001,8(5):260

22 金磊.粒細胞集落刺激因子的制備.中國專利: 98103011.4,1999-02-03

23 Carlos R J Soares,Fernanda I C Gomide,Eric K M Ueda,etal.Periplasmic expression of human growth hormone via plasmid vectors containing the λPLpromoter: use of HPLC for product quantification.Protein Engineering Design & Selection,2003,16(12):1131