海洋生物抗菌肽在枯草桿菌BS168中的高效表達

(蚌埠學院 生物與食品工程系,安徽 蚌埠 233030)

馬蹄蟹(Horseshoe crab)是一類遠古的海洋節肢動物。馬蹄蟹血細胞中分離提取的一類抗菌肽[1],具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抑制腫瘤細胞增殖和誘導癌細胞分化的生物活性[2]。抗菌肽tachyplesinⅠ因相對分子質量小不具備抗原性,對原核生物細胞有很高的殺菌活性,對真核生物的正常細胞則無明顯毒副作用。抗菌時一般沒有特殊受體,不會誘導抗藥菌株的產生,是一類具有巨大潛在應用價值的抗菌肽。但由于馬蹄蟹是一種珍貴的海洋生物,物種稀少,是瀕臨滅絕生物,且 tachyplesinⅠ的分離純化過程繁瑣且費用較高;通過化學合成制備,價格昂貴,生物活性低;因此采用基因工程制備tachyplesinⅠ成為一種可行的方案[3]。

目前,利用基因重組技術在體外大量制備活性多肽是生物制品研究的熱點之一。對于分子質量較小的多肽,如果用常規方法構建單拷貝基因的重組質粒,則目的基因在細胞中的表達量很低,無法體現基因工程產量高的優勢。因此,本文建立了一種構建串聯基因的方法,以實現小分子多肽在體外的高效表達,為小肽的串聯表達提供了理論和實踐依據。本研究為了克服基因工程制備 tachyplesinⅠ的缺陷,設計構建 tachyplesinⅠ基因串聯表達載體,并將重組基因成功轉化到分泌型表達系統枯草桿菌 BS168中,實現了抗菌肽tachyplesinⅠ的高效分泌表達。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質粒

克隆宿主菌Escherichia coli.DH5α、大腸桿菌E.coliK88、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)為本室保存;枯草桿菌Bacillus subtilisBS168為表達宿主菌,由上海生命科學院植物生理與生態研究所惠贈;TA克隆載體 pUCM-T購自上海生工公司;大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒 pSBPTQ[4]由中山大學羅進賢教授惠贈。

1.1.2 培養基和主要試劑

馬蹄蟹購自廣東省深圳市水產品市場;枯草桿菌感受態制備用GMI、GMII培養基[5];發酵用MSR培養基[6]。cDNA合成試劑盒及各種工具酶均購自TaKaRa公司;Trizol reagent購自 Invitrogen公司;蛋白分子質量標準、mRNA純化試劑盒購自Promega公司;CM Sepharose購自Amersham Biosciences;其他生化試劑(分析純)購自上海生工;實驗中所用引物(由上海生工合成),各引物設計如表1所示。

表1 所用引物表Tab.1 PCR primers

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽tachyplesinsⅠ基因的RT-PCR擴增

從馬蹄蟹圍心腔采集血液,8 000 r/min 離心10 min 獲得血細胞[7],用 Trizol處理提取總 RNA,以 mRNA 純化試劑盒獲得 mRNA。反轉錄合成cDNA,進一步以cDNA 為模板,參考Genbank收錄的 tachyplesinⅠ基因序列,設計了上下游引物Tac-1和Tac-2,見表1。并設計了XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點和保護堿基。PCR擴增獲得的目的基因tac,經2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳檢測后測序。

1.2.2 串聯基因(2tac)的設計

參照 Genbank上公布的基因序列,設計合成兩條完全互補單鏈 tachyplesinsⅠ串聯基因,5’端設計XbaⅠ黏性末端,3’端設計KpnⅠ黏性末端。通過上海生工公司合成帶有上述黏性末端的完全互補的堿基序列,退火合成帶有黏性末端的雙鏈串聯tachyplesinsⅠ基因。方法合成如下：取等量摩爾濃度25 μmol/L的正反義引物各 4 μL,添加超純水至40 μL。退火條件：80℃水浴退火5 min,然后自然冷卻至30℃,其過程大概3 h。退火合成串聯基因(2tac)克隆連接到pUCM-T上進行初步鑒定及目的串聯基因的擴增。

1.2.3 串聯基因2tac的克隆鑒定及體外PCR擴增

克隆載體 pUCM-T經限制性內切酶XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切后,和tachyplesinⅠ基因tac及 2tac經T4 DNA 連接酶連接。轉入大腸桿菌DH5α培養,經過藍白斑篩選得陽性克隆,培養提取質粒。經雙酶切初步鑒定,再通過測序進一步驗證克隆片斷的正確性。所得克隆質粒命名為 pUCM-2TAC和 pUCMTAC。

1.2.4 表達載體的構建及鑒定和重組質粒轉化

以 pUCM-2TAC質粒模板,通過引物 M13經PCR擴增得到串聯基因2tac,PCR反應條件：94℃預變性10 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共進行35個循環;最后72℃延伸10 min。將PCR產物和表達載體 pSBPTQ同時進行XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切,T4 DNA連接酶連接,大腸桿菌轉化按Sambrook的方法進行[8]。轉化后篩選陽性克隆,雙酶切鑒定,測序驗證。所得質粒命名為 pSBPTQ-2TAC,重組表達質粒 pSBPTQ-TAC和 pSBPTQ-2TAC轉化枯草桿菌BS168的方法參照Harwood[9]方法進行。

1.2.5 誘導表達及SDS-PAGE電泳分析

挑取新鮮轉化的枯草桿菌工程菌BS168/pSBPTQ-TAC和 BS168/pSBPTQ-2TAC單菌落接種于含卡那霉素(10 mg/L)的LB培養基中,37 ℃ 250 r/min培養過夜,作為種子液。然后種子液按5 %接種量轉接于含卡那霉素(10 mg/ L)的發酵培養基(MSR)中,37℃ 250 r/ min 振蕩培養2～4 h,加蔗糖至終濃度2 %誘導表達[10],每隔 12 h依次取樣,收集的發酵液經10 000 r/min離心 15 min,取發酵液上清進行Tris-Tricine SDS-PAGE(16.5%)電泳檢測,以確定最佳誘導時間。用含質粒 pSBPTQ的對照菌體和標準蛋白作對照。

1.2.6 重組tachyplesinⅠ的分離純化

收集發酵液12 000 r/min,離心15 min。向發酵上清液中依次加入硫酸銨使終濃度達到35%、45%、55%、65%、75%,12 000 r/min離心30 min,收集沉淀,用pH7.4的Tris-HCl緩沖液溶解沉淀。將鹽析濃縮效果最好的溶液裝入透析袋中進行透析。透析產物上CM -Sepharose層析柱,用10 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)平衡洗脫柱,然后用相同緩沖溶液配制的0～1.0 mol/L的NaCl線性梯度洗脫(2 mL/min),收集活性峰,對收集樣品經冷凍干燥濃縮,用無菌水配得 tachyplesinsⅠ表達產物溶液 10 mL。參照謝海偉等[11]高效液相色譜方法檢測 tachyplesinⅠ表達產物含量。

1.2.7 TachyplesinⅠ串聯表達產物2TAC的水解及活性檢測

取兩份各為 1.0 mL冷凍干燥的串聯表達產物2TAC,將其中一份溶于 1.0 mL BrCN溶液(50 g/L,70 %甲酸配制)中,另一份溶于僅含70 %甲酸溶液中,同時置于 4 ℃冰箱水解處理 24 h,水解后再加1.0 mL的雙蒸 H2O,冷凍干燥以除去甲酸和 BrCN,干制品用無菌水重新配制成1.0 mL溶液進行活性檢測。上述2TAC水解液產物進行活性鑒定,以大腸桿菌 K88和金黃色葡萄球菌為試驗菌株,分別取5 mg/L的2TAC和TAC,10 mg/L的2TAC和2TAC水解產物,以 BS168/pSBPTQ空質粒菌株發酵液為對照,參照微量肉湯稀釋法[12]進行抗菌活性檢測。同時以上述TAC對供試菌株孵育,參照代建國等[13]建立方法進行透射電鏡觀察,分析細胞微觀結構的變化。

2 結果與分析

2.1 TachyplesinⅠ串聯基因(2tac)的設計

TachyplesinⅠ串聯基因的設計如圖1所示,在單 tachyplesinⅠ基因tac的 3’端添加“AAC”密碼子,目的為了使 tachyplesinⅠ基因表達產物 C末端產生酰氨化結構,兩個 tachyplesinⅠ基因通過蛋氨酸密碼子“ATG”連接,目的在于增添表達產物的BrCN水解位點。為了便于和表達載體連接,在串聯基因的5’端設計XbaⅠ酶切位點黏性末端,后加兩個“AA”為使串聯基因 2tac在表達載體的正確閱讀框內,使其能正確表達,其前加“AA”作為保護堿基。

圖1 tachyplesinⅠ串聯基因2tac的設計Fig.1 Design of tandem gene of tachyplesinⅠ

2.2 串聯基因2tac重組表達載體的構建

將大腸桿菌質粒 pSP72的復制起點及氨芐青霉素抗性基因轉移到枯草桿菌質粒pUB18上構建了大腸桿菌-枯草桿菌穿梭型克隆載體 pSB。然后將枯草桿菌sacB基因的啟動子-信號肽序列(sacB P.S.)及地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的轉錄終止信號T(amyT)克隆進 pSB,獲得誘導型表達-分泌載體 pSBPT,最后將短小芽孢桿菌正調控基因degQ引入pSBPT,獲得重組質粒pSBPTQ,構建過程見圖2。含2tac基因的重組質粒的構建如圖3所示,將pSBPTQ用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切,電泳回收7.5 kb大片段,與經XbaⅠ /KpnⅠ酶切的 PCR產物連接,構建含2tac基因的重組質粒。

圖2 穿梭型誘導表達載體構建 [4]Fig.2 The expression plasmid pSBPTQ

圖3 重組表達載體pSBPTQ-2TAC的構建Fig.3 The recombinant expression plasmid pSBPTQ-2TAC

2.3 TachyplesinⅠ基因(tac)的 RT-PCR 擴增以及電泳鑒定

從馬蹄蟹細胞中提取總 RNA,根據tachyplesinⅠ基因序列設計的引物Tac-1和Tac-2,以馬蹄蟹血細胞cDNA為模板擴增的PCR產物,產物經凝膠電泳分析,如圖4所示。在泳道2中出現一條70 bp左右的DNA 條帶。采用退火法合成的串聯基因2tac,經凝膠電泳分析,在泳道1中出現一條120 bp左右DNA條帶。初步證明獲取了目的基因tac和2tac。

圖4 tachyplesinⅠ基因tac和2tac 的PCR產物電泳圖Fig.4 PCR product of tac gene and 2tac

圖5 重組子pSBPTQ-TAC和pSBPTQ-2TAC的酶切鑒定Fig.5 Restriction enzyme analysis of pSBPTQ-TAC and pSBPTQ-2TAC

2.4 重組表達載體的鑒定

重組質粒經過雙酶切后凝膠電泳圖見圖5,結果顯示在約80 bp、150 bp和7.4 kb處有預期的條帶。初步證明目的基因tac和2tac已經克隆到表達載體上。重組子進行測序,測序圖譜如圖6,7所示,測序結果采用軟件 CLUSTAL(1.81)進行克隆序列和已知tachyplesinⅠ基因序列進行比對分析。核苷酸序列比對結果,重組子基因tac和 2tac核苷酸序列和已知tachyplesinⅠ基因序列完全相同,長度分為 56 bp、119 bp,這表明tachyplesinⅠ基因tac和2tac成功克隆到pSBPTQ載體中,通過測序圖譜進一步表明,目的基因連接順序和啟動子方向一致,在表達載體的正確閱讀框內,重組子命名為 pSBPTQ-2TAC和pSBPTQ-TAC。

2.5 重組轉化菌的誘導表達及 SDS-PAGE鑒定

與對照 BS168/pSBPTQ發酵液相比,在重組子BS168/pSBPTQ-2TAC和BS168/pSBPTQ-TAC的電泳圖中出現一條明顯的蛋白條帶,如圖8中箭頭所指條帶分別大小約為2.0 KD和5.0 KD,表達產物大小與天然 tachyplesinⅠ多肽和其串聯體的相對分子質量大小相符,由此可以初步確認目的蛋白 2TAC和 TAC在宿主菌種得到了有效地表達,并且分泌到發酵液中。采用凝膠成像系統分析軟件 GeneTools對SDS-PAGE電泳的結果進行分析,對圖8中2,3泳道進行掃描,經峰面積積分計算出目的條帶的吸收峰在所有表達蛋白的吸收峰中所占的百分含量,即為目的蛋白在表達的全蛋白中的百分含量。本實驗比較的是TAC和2TAC蛋白在全蛋白中的百分含量,經GeneTools軟件分析,重組表達產物TAC和2TAC蛋白表達量分別約為8.5%、15.8%。

工程菌株B.subtilisBS168/pSBPTQ-2TAC和BS168/pSBPTQ-TAC,經蔗糖誘導后,每隔 12 h取樣進行 SDS-PAGE電泳檢測。由圖9可以看出,目的蛋白2TAC和TAC隨著誘導時間的增加,表達量也在增加,當誘導24 h時,表達產量達到最高值。

2.6 表達蛋白2TAC和TAC的分離純化及SDS-PAGE鑒定

通過不同飽和濃度的硫酸銨對表達產物進行鹽析初步純化,濃縮產物進行 MIC 檢測,目的蛋白沉淀量與硫酸銨濃度的關系見圖10所示,用55%飽和度的硫酸銨處理后,濃縮液抗菌活性最強,用55%飽和度的硫酸銨進行鹽析可得到最大量的目的蛋白。因此,在分離純化過程中,先用55%飽和度的硫酸銨沉淀目的蛋白,進行濃縮處理。

圖6 重組表達質粒pSBPTQ-2TAC測序圖譜Fig.6 DNA sequence of pSBPTQ-2TAC

圖7 重組表達質粒pSBPTQ-TAC測序圖譜Fig.7 DNA sequence of pSBPTQ-TAC

發酵液經 55%飽和度的硫酸銨鹽析沉淀后,在蒸餾水中透析。透析液經CM-Sepharose Fast Flow柱層析,結果圖12(A,B)中顯示出現 4個蛋白峰,對各個峰進行抗菌活性分析后,第Ⅳ峰具有抗菌活性,如圖12(A,B)中箭頭所指。目的產物所在的第Ⅳ峰在低濃度0.1～0.2 mol/L左右的NaCl被洗脫下來,冷凍干燥,用無菌水配得 tachyplesinⅠ表達產物溶液10 mL。離子交換柱收集的表達產物,經高效液相色譜分析濃縮的表達產物TAC和2TAC的濃度分別為5.46 mg/L和10.36 mg/L。純化后經過SDS-PAGE分析結果見圖11,由電泳結果可見,重組的 2TAC和TAC表達產物經分離純化后,獲得均一的蛋白條帶,分子質量大小和上述鑒定相符。表明重組的 2TAC和TAC表達產物獲得成功。

圖8 表達產物2TAC和TAC的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

圖9 不同誘導時間下表達產物 2TAC和 TAC的 SDSPAGE分析Fig.9 SDS-PAGE of 2TAC and TAC at different induced times

圖10 發酵液在不同硫酸銨飽和度鹽析下的相對活性Fig.10 The relative activity of fermentation in different concentrations of (NH4)2SO4

2.7 對發酵上清液進行了活性鑒定,抑菌活性鑒定

通過對表達產物TAC和2TAC以及2TAC的水解產物的抑菌圈觀察,誘導表達的目的蛋白溶液對E.coliK88和S.aureus的抑菌試驗結果見(圖13)。從圖13可以看出,tachyplesinⅠ串聯表達產物2TAC的抑菌圈明顯小于單拷貝表達產物 TAC的抑菌圈,而2TAC經BrCN水解后的抑菌圈又明顯大于單拷貝表達產物 TAC的抑菌圈,這表明 tachyplesinⅠ串聯體2TAC經水解后對大腸桿菌K88和S.aureus都具有明顯的抑菌活性。

圖11 純化后2TAC和TAC的SDS-PAGE分析Fig.11 SDS-PAGE analysis of purified TAC and 2TAC

同時表達產物TAC和供試菌大腸桿菌K88,金黃色葡萄球菌(S.aureus)共同孵育后,從透射電鏡觀察(圖14)發現,對照組(圖14-A,C)細胞結構完整,細胞外觀平滑,細胞壁膜完整,細胞飽滿,細胞內容物充實、致密;處理組(圖14-B,D)可以看出幾點變化,部分細胞膜出現裂解,基本細胞形態保持,細胞外觀粗糙,部分細胞壁膜裂解,處理后金黃色葡萄球菌有兩處明顯的細胞膜出孔道現象,細胞質結構松弛,出現少許絨毛;處理后大腸桿菌 K88細胞質內空,部分細胞器和細胞核區消失。上述透射電鏡觀察表明表達產物TAC具有抗菌活性。

圖12 CM-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析圖Fig.12 2TAC and TAC purified by CM-Sepharose

圖13 TAC和2TAC及水解后2TAC對E.coli K88和S.aureus的抑菌圈

3 討論

本實驗通過前期對 tachyplesinⅠ抗菌譜的研究[10],發現抗菌肽 tachyplesinⅠ對枯草桿菌的抑制作用,明顯低于對大腸桿菌的抑制作用,因此我們嘗試利用枯草桿菌進行tachyplesinⅠ的表達。本實驗首次完成了 tachyplesinⅠ在枯草桿菌表達系統的高效表達,在此之前進行的抗菌肽 tachyplesinⅠ或類似抗菌肽的基因表達研究中,只有通過大腸桿菌和酵母表達系統表達成功的,但表達產量都很低。如張春義[14]用大腸桿菌表達成功,對黃曲霉孢子具有活性;張鈁等[15]成功表達出抗菌肽 polyphemusinⅡ,并具有抗菌活性。

圖14 產物TAC處理的透射電鏡圖及未處理對照Fig.14 Transmission electron microscopy of S.aureus and E.coli K88 after treated by TAC

本實驗首次用枯草桿菌表達系統進行tachyplesinⅠ串聯表達,利用大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達載體pSBPTQ實現了串聯基因2tac和單拷貝基因tac在枯草桿菌 BS168中高效的表達。從表達產物的生物活性可以看出,串聯表達產物 2TAC具有抗菌活性,但其抗菌活性低于單拷貝表達產物TAC,當串聯表達產物2TAC用BrCN水解后,水解液的抗菌活性明顯增加,其最小抑菌濃度和單拷貝表達產物TAC相近。同時串聯表達蛋白在連接處通過溴化氫水解后,可使表達產量增倍,這種方法有利于提高 tachyplesinⅠ表達產量,同時降低表達產物對宿主細胞的毒性,實現 tachyplesinⅠ的高效表達。這一研究結果為tachyplesinⅠ高效表達提供了重要研究方法,具有非常重要應用價值。

本實驗采用枯草桿菌表達系統和串聯基因表達方式,克服了表達產物對宿主的抑制作用,大大提高了產量,取得一定成功,但仍有許多地方需要改進：(1)本實驗采用的宿主菌 BS168是枯草桿菌表達系統中的最為廣泛應用宿主菌,有許多優點,并在本實驗中表達成功,但宿主菌 BS168仍然存在一定問題,在BS168中已發現堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、中性蛋白酶 B和三種絲氨酸蛋白酶等多胞外蛋白酶,當外源蛋白分泌表達后,容易被這些蛋白酶降解,從而大大降低產率。枯草桿菌的這種的特性,可能部分水解抗菌肽,造成表量低,在枯草桿菌 168宿主菌基礎上通過蛋白酶基敲除等手段,已經發展到多種蛋白酶缺陷型的宿主菌,如 8種蛋白酶的缺陷型WB800是剔除8種蛋白水解酶的工程菌,因此可選擇更理想的表達系統[16]。另外可以在本文基礎上選擇一些真菌表達系統,如酵母表達系統,霉菌表達系統或植物表達系統;(2)鑒于本實驗 2拷貝的串聯基因可以實現正確的表達,因此可以通過設計新的串聯基因方法,實現多拷貝的串聯基因進行表達,以進一步降低表達產物對宿主抑制,同時水解后成倍提高抗菌肽產量;(3)根據抗菌肽tachyplesinⅠ氨基酸序列特點,尋求更合理且無毒害的酶切位點;設計更為合理的,用無毒的,成本低的酶水解代替BrCN水解。

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