烏蘇里擬鲿野生群體和人工養殖群體遺傳多樣性的比較研究

(蘇州大學 醫學部基礎醫學與生物科學學院,蘇州大學 水產研究所,江蘇 蘇州 215123)

烏蘇里擬 (Pseudobagrus ussuriensis)曾用名烏蘇里,俗稱牛尾巴,隸屬于硬骨魚綱(Dsteichthyes)、輔鰭亞綱(Actinopteri)、鲇形目(Silurformes)、科(Bagridae)、擬 屬(Pseudobagrus)。因其雜食性、生長快、肉質鮮等特點,成為優良的養殖品種[1]。同其他許多魚類一樣,烏蘇里擬 的養殖群體是依靠采捕野生親魚進行大量繁殖而來的,隨著人工繁殖技術的突破以及天然野生親魚群體數量的嚴重不足,難免會導致近親繁殖的發生。多代烏蘇里擬 自交養殖群體可能會產生基因庫萎縮和經濟性狀衰退等問題,這將嚴重影響烏蘇里擬 種質資源保護及其養殖業的進一步發展。目前,有關于烏蘇里擬 的研究主要集中在人工繁育、生化遺傳學等領域[2-4],至于其分子方面的研究尚未見到報道。相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)具有簡便、穩定、中等產率和容易得到選擇條帶序列等優點[5-6],已越來越多地被應用于植物和動物包括魚類基因組的分析中[7-9]。本文在確定該技術對烏蘇里擬 遺傳多樣性分析適用性的基礎上,通過比較烏蘇里擬 野生群體和人工養殖群體間的遺傳結構差異,首次從分子水平探討烏蘇里擬 遺傳多樣性的變化,為制定烏蘇里擬 的種質標準提供基礎資料,也為該魚人工養殖群體的遺傳結構是否產生遺傳變異提供理論依據。從而為其珍貴的野生資源的可持續地利用以及養殖業的可持續發展提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

烏蘇里擬 野生群體采自江蘇省洪澤湖(HL,32尾);淮安市水產研究所的人工繁殖群體(HA,34尾,F2代)為2006年人工繁殖的烏蘇里擬 ,其親本(F1代)是 2000年由洪澤湖捕獲的野生成魚繁殖而來的;蘇州市東山水產養殖場的人工繁殖群體(SZ,31尾,F3代) 為 2009年人工繁殖的烏蘇里擬 ,其親本(F2代)是2006年底從淮安市水產研究所購進的1萬尾烏蘇里擬 夏花培育而成的。本實驗從以上 3個群體中隨機取樣的情況見表1。

表1 3個烏蘇里擬鲿群體的樣本量、體長及體質量范圍Tab.1 Amount of samples,body lengths,and body weights of Pseudobagrus ussuriensis

1.2 基因組DNA的提取

剪取鰭條0.1 g,加200 μLSTE緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl,10 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA),20μLSDS,5μL蛋白酶K(20 g/L),于55℃下消化過夜,之后用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法提取其基因組DNA,經 l%瓊脂糖凝膠電泳檢測,分光光度法定量分析,將DNA稀釋至0.05 g／L。

1.3 SRAP引物

參照文獻[10]和文獻[11]設計引物,引物由上海生物工程公司合成,其序列見表2。上下有交叉組合得到100對引物。Taq酶、dNTP、DNA Maker等均為上海生工產品。

表2 SRAP引物Tab.2 Primers and sequences of SRAP

1.4 SRAP-PCR反應及電泳檢測

PCR反應總體積為25 μL,包括PCR Buffer 2.5μL,Mg2+2 μL,dNTPs 0.2 mmol/L,DNA 模板(0.05 g／L)1 μL,1.0 μmol/L 引物 1 μL,Taq 酶 1.0 U。反應的程序為：94℃預變性5 min,94℃變性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸2 min,5個循環;94℃變性1 min,53℃退火1min,72℃延伸2 min,35個循環;72℃下延伸7 min。擴增產物經8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染法染色,數碼相機拍攝保存。

1.5 數據處理

用Gel-Pro analyzer對顯色后的SRAP電泳圖譜進行統計分析,每一條帶視為一個位點,有帶記為“1”,無帶記為“0”。轉換成數字矩陣再進行分析,選擇基因頻率作為比較指標,用 PopGene軟件進行分析,并統計相應的數據。相關計算公式如下：

(1) 群體多態位點Pi=該群體的多態位點數/位點總數×100%

(2) 隱性等位基因a的基因頻率q是根據群體中隱性純合個體(即對應某一擴增位點,不出現該擴增帶的個體) 頻率的平方根計算而來,對應的顯性等位基因A 的基因頻率p= 1-q,文中提到的基因頻率均為每位點顯性等位基因的基因頻率。

(3) 遺傳相似系數Sij=Nij/ (Ni+Nj+Nij)[12]

其中,Sij為任意兩個個體間的遺傳相似系數,Nij為i個體和j個體共享位點數,Ni、Nj分別為i個體和j個體各自擴增的位點總數。群體間的遺傳相似系數為兩群體任意兩個體遺傳相似系數的平均數。Sij為兩群體間的遺傳相似系數;Si、Sj分別表示群體i和群體j的遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增結果

圖1 部分引物對烏蘇里擬 3個群體的擴增結果Fig.1 PCR amplification in the three populatins

用篩選出的12對SRAP引物組合對3個烏蘇里擬 群體共擴增出202個清晰穩定的位點(圖1),每組引物對烏蘇里擬 3群體擴增均產生 11～17個擴增位點,片段大小在 572～111bp,其中多態位點有130個,多態位點比例為64.36%。對各引物組合擴增的位點總數及多態位點比例的統計結果發現,不同引物組合在 3個群體中的擴增位點總數和多態位點數均有顯著差異(表3)。但是,除 F8R8引物組合中,野生群體的多態位點數少于兩個養殖群體的多態位點數外,其他各引物組合在野生群體中所擴增出的多態位點數均多于2個養殖群體,野生HL群體的多態位點率為 63.13%,養殖 HA群體的多態位點率為56.54%,而養殖SZ群體的多態位點率為54.88%。

表3 3個群體擴增位點數及多態位點比例Tab.3 Number of ampliphied loci and the percentages of polymorphic loci in the three populations

2.2 三個群體擴增位點數在不同顯性基因型頻率的分布

參照張志偉等[14]和張全啟等[15]的方法,將 202個擴增位點的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區間,0和 100%分別設為單獨的區間,這樣共劃分為12個區間,統計顯性基因型頻率在各區間內的位點數。結果表明,3個群體在不同顯性頻率區間內的擴增為點數呈現一定的分布規律,反映了 3個群體的遺傳結構特點。2個養殖群體在不同區間內的分布規律基本相同,在 100%區間位點數較多,其他區間位點數則相對較少,在不同區間位點數的變化規律則基本一致,這表明兩個養殖群體的遺傳結構非常相近;與野生群體的比較顯示,在 1%～9%區間內野生群體的多態位點顯著多于兩個養殖群體,位點數分別為野生群體53個、養殖群體21個、養殖群體24個,在100%區間野生群體位點數顯著少于養殖群體,其他區間野生群體與養殖群體的位點數分布規律則無顯著差異(圖2)。這表明養殖群體中的隱形純合位點明顯高于野生群體,養殖群體中的低頻位點顯著減少,養殖群體的遺傳多樣性水平有所降低。

圖2 烏蘇里擬 3群體擴增位點數在不同顯性基因型頻率區間內的分布Fig.2 Distributions of amplified loci of the three populations in different frequency intervals

2.3 3個群體的遺傳多樣性指數及遺傳距離

Nei’s基因多樣性指數(H)和 Shannon’s信息指數(I)是衡量群體遺傳多樣性的重要參數。Nei’s基因多樣性指數(H)反映的是群體在數個基因座位上的遺傳變異,是最適合衡量群體遺傳變異的一個參數,其值的大小可以反映群體遺傳變異的高低。從表4中可以看出,烏蘇里擬 野生群體的Nei’s基因多樣性指數和Shannon’s信息指數(I)更高,兩個養殖群體的Nei’s基因多樣性指數和 Shannon’s信息指數(I)則相對較低,這表明野生群體的遺傳多樣性水平高于養殖群體。從表5中可以看出,HL野生群體與HA養殖群體間的遺傳距離最大為 0.1730,兩個養殖群體間的遺傳距離最小為0.1087,HL野生群體與SZ養殖群體間的遺傳距離居中。這表明養殖群體存在較為嚴重的遺傳分化,且遺傳多樣性水平降低。

表4 烏蘇里擬鲿3群體的遺傳多樣性指數Tab.4 Genetic diversity indices of each population

表5 烏蘇里擬鲿3群體的遺傳相似系數及群體間的遺傳距離Tab.5 Intra-population genetic similarity and relative genetic distances among three populations

3 討論

3.1 SRAP在烏蘇里擬 遺傳多樣性研究中的適用性

SRAP呈顯性標記,一條帶代表一等位基因[16]。其主要是利用獨特的引物設計,對開放式閱讀框架進行擴增。正向引物長 17bp,5′端的前10bp是一段填充序列,緊接著是 CCGG,它們組成核心序列,核心序列及3′端的3個選擇性堿基,能對外顯子進行特異擴增。反向引物長18bp,5′端的前10-1lbp是一段填充序列,緊接著是 AATT,它們組成核心序列,在3′端3個選擇堿基的協同作用下,對內含子區域、啟動子區域進行特異性擴增[17]。SRAP由于其獨特的引物設計原則以及其成本低、重復性強、穩定等優點,已廣泛應用于作物及水產動物種質資源方面的研究[18-20]。鄭翠芳等[21]采用 153對引物對愛玉子的性別及品系進行了研究,得到一 200bp的特異條帶將雌雄株分開,并用8對引物對24個雌性品系和16個雄性品系進行比較擴增,顯示較高的多態性。張志偉等[14]采用88對引物對草魚的3個群體進行SRAP分析,結果表明草魚人工繁殖群體的遺傳多樣性水平有所下降。辛文婷[22]采用 100對引物構建了基于SRAP分子標記的黃顙魚遺傳圖譜。傅洪拓等[23]采用SRAP分子標記對海南沼蝦的5個中群體進行遺傳多樣性分析,為海南沼蝦的種質資源保護和利用提供了理論依據。本研究構建了適用于烏蘇里擬 分子標記的 SRAP反應體系,并篩選出合適的引物組合,對烏蘇里擬 1個野生群體和2個人工養殖群體的遺傳結構進行了比較研究,表明 SRAP分子標記同樣適用于烏蘇里擬 遺傳多樣性的分析。

3.2 魚類野生群體與人工養殖群體間的遺傳多樣性分析

作者采用穩定性強、產率高的 SRAP分子標記首次對烏蘇里擬 1個野生群體和2個人工養殖群體的遺傳結構進行比較,3個群體(HL群體、HA群體、SZ群體)的多態位點比例分別為63.13%、56.54%、54.88%;Nei’s基因多樣性指數(H)為 0.2641、0.2546、0.2469;Shannon’s 信息指數(I)為 0.4118、0.4050、0.3861。與野生群體相比,2個養殖群體的多態位點比例、Nei’s 基因多樣性指數(H)、Shannon’s 信息指數(I)有著不同程度的下降,這說明養殖群體遺傳多樣性水平較低,且存在較為明顯的遺傳分化趨勢。不同學者在其他物種的研究中同樣發現類似現象,如：張志偉等[14]采用 SRAP分子標記技術對草魚野生群體和人工繁殖群體遺傳結構的比較研究發現：草魚養殖群體期望雜合度平均值顯著低于野生群體,部分等位基因丟失,推測主要是親本數量少以及養殖環境發生改變,使得養殖群體出現中指上的同質化,致使部分等位基因丟失;張全啟等[15]采用 AFLP分子標記技術在對牙鲆野生群體和養殖群體的遺傳多樣性分析時不僅檢測到養殖群體的遺傳雜合度降低,還檢測到由于低頻位點的丟失造成總數目位點的減少,推測可能是由于在人工繁殖過程中一些不合理的因素(如繁殖親魚數量少、遺傳漂變等)造成的。潘偉志等[4]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對黑龍江水系烏蘇里擬 心、肝、腎、眼、肌肉和性腺共 6種組織進行了 9種同工酶生化遺傳學分析,結果表明,烏蘇里擬 EST、GDH、IDH、POD同工酶譜中存在不同程度的組織特異性,EST表現出明顯的性別差異性。他們還通過電泳酶譜帶命名和遺傳學參數計算的方法,共記錄了 19個基因位點,多態位點百分數P=21.05%,種群遺傳偏離指數d=-1,該烏蘇里擬 種群內部雜合子缺失較嚴重,偏離 Hardy-Weinberg平衡,養殖群體遺傳多樣性較低,這也與本文的研究結果相吻合。潘偉志等[3]對烏蘇里擬 繁殖生物學的研究結果表明,體長 225～468mm 個體的絕對懷卵數為(2684±1029)粒,發現比野生群體自然繁殖期中的懷卵數量少,這可能與養殖群體遺傳結構的改變有關。我們對F3代進行人工繁殖時也發現了類似現象,是由于養殖群體的遺傳多樣性降低還是環境和養殖條件等因素改變導致的繁殖力下降,有待于進一步研究。

本研究采用 SRAP分子標記技術檢測到養殖群體的遺傳多樣性有所降低,還發現在養殖群體中低頻位點顯著減少,而隱性純合基因顯著增加。推測其原因,可能是養殖群體的親本數量比較少,尤其在人工繁殖時由于雄魚個體遠大于雌性個體,常常出現雌雄親魚數量比例過高的現象,導致人工養殖群體遺傳結構發生改變,遺傳漂變的結果使得后代中一些稀有位點丟失、低頻位點顯著減少,而隱性純合基因顯著增加。但從遺傳距離及遺傳分化的角度分析,人工養殖群體還沒有形成獨立的遺傳結構。因此,在未來烏蘇里擬 的保種或人工繁殖和養殖工作中,應該注意親本的更新,并選用足夠大的、有代表性的親本群體,尤其在人工繁殖時要保證雄性親魚的使用量,從而在保持優良性狀的同時最大限度的保留群體的遺傳多樣性,以促進烏蘇里擬 種質資源保護和養殖產業的可持續發展。

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