羊鮑野生群體遺傳多樣性與分化的研究

(集美大學 水產學院,水產生物技術研究所,福建 廈門 361021)

羊鮑(Haliotis ovina)屬鮑科。其殼與肉皆可入藥,且肉質細嫩、營養價值高,是中國重要的經濟鮑類之一。羊鮑在中國主要出產于海南及西沙群島海域。近年來由于酷漁濫捕及海區生境不斷惡化等原因,羊鮑的自然資源受到嚴重破壞,這對原本就不大的羊鮑天然捕獲量來說猶如雪上加霜。對羊鮑自然資源的保護已經刻不容緩。而對于羊鮑遺傳背景的深入了解是制定科學有效的保護措施的必要前提。關于羊鮑遺傳學方面的研究已有相關報道[1-4],但迄今尚未發現采用隨機擴增片段長度多態性 DNA 標記(RAPD)技術,對產于中國的羊鮑野生群體進行遺傳多樣性分析的報道。

RAPD標記技術誕生于1990年,由于其具有操作簡單、成本低廉且無需專門設計擴增引物等特點而被廣泛應用于遺傳圖譜的構建、基因定位、遺傳多樣性分析、物種或品種鑒定、親緣關系確定及良種選育等諸多遺傳學研究領域[5-9]。在經濟貝類的群體遺傳學分析方面,RAPD技術已成功運用于縊蟶(Sinonovacula constricta)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)、大連灣牡蠣(Crassostrea talienwhanensis)、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)、文蛤(Meretrix meretrix)等物種的研究[10-15]。表明 RAPD技術既能夠獲得足夠多的分子標記來用于分析不同群體的遺傳多樣性,又可通過數據處理來判斷不同群體間的遺傳分化程度[13]。

本研究采用 RAPD技術,對中國羊鮑野生群體的遺傳多樣性與遺傳分化進行分析探討,以期為中國羊鮑種質資源的保護、自然資源的可持續利用及良種選育提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用野生羊鮑分別采自中國海南省的英州、安游及亞龍灣,每個群體隨機取樣 30個,取得的新鮮樣品加冰保存,運至實驗室后放入-40℃冰箱保存至分析。

1.2 基因組DAN的制備

DNA提取主要參照傳統的酚/氯仿抽提法,略做修改。具體步驟如下：每個個體取足部肌肉組織50～100 mg,剪碎放入1.5 mL離心管中。加入700 μL由 2×CTAB(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0;0.5 mol/L EDTA,pH8.0;1.4 mol/L NaCl;0.02 g/mLCTAB),0.2 μL β-2 巰基乙醇及 15μL 蛋白酶 K(20 g/L)組成的CTAB消化液于振蕩器上振蕩均勻,55℃消化過夜。待肌肉組織完全消化后加入 700 μL氯仿 ：異戊醇(24 ：1)混合液,顛倒混勻15 min,離心 10 min(12 000 r/min)。離心后吸取上清液至另一個新管。再加入600 μL 苯酚 ：氯仿 ：異戊醇(25 ：24 ：1)混合液進行抽提,提取后的上清液再加入 600 μL 氯仿 ：異戊醇(24 ：1)混合液抽提一次,加入 800 μL經-20℃預冷的異丙醇,顛倒混勻,-20℃存放 2 h后離心 10 min(10 000 r/min),產生白色沉淀,棄上層液體,保留離心管底部沉淀,再先后用經-20℃預冷的 1mL70%與1mL 100%的乙醇緩慢顛倒洗滌 DNA沉淀,各自離心 10min(10 000 r/min),棄上層液,保留沉淀。將DNA樣品置于空氣中晾干;干燥后的 DNA樣品加入100 μL ddH2O,放入4℃冰箱充分溶解。用0.8%瓊脂糖電泳檢測溶解后的DNA的質量。

1.3 RAPD擴增反應

RAPD反應條件參照Williams 等的方法[16]。反應總體積為 25 μL,其中 1×Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1 μL,Taq 酶(5U/μL)0.3μL,引物(5 mg/L)3μL,模板 DNA 50 ng,其余的部分用ddH2O補足。于PCR儀上進行擴增反應。PCR反應條件：首先經94℃預變性4 min,后進入45個PCR循環：即94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min。最后再經72℃繼續延伸10 min。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,EB染色,紫外投射儀檢測并拍照記錄。

1.4 數據處理

對電泳后凝膠上清晰可見的擴增條帶進行記錄,在同一遷移位置有帶的記為“1”,無帶則記為“0”,列出“0”,“1”矩陣,輸入統計軟件 POPGENE 1.32 進行統計分析,獲得羊鮑 3個群體的多態位點百分數(P)、Shannon’s 信息指數(I)、Nei’s 基因多樣性指數(H)、群體間的遺傳距離(D)、群體間基因分化系數(GST)等遺傳學參數。并由程序 NEIGHBOR中的 Neighborjoining構建羊鮑3個群體的聚類分析圖。

2 結果

2.1 引物篩選與RAPD擴增結果

本研究采用40個隨機引物進行RAPD擴增實驗,從中優化出14個能擴增出清晰條帶、并可重復的有效引物(表1,引物S97對3個羊鮑野生群體的RAPD擴增圖譜見圖1)。用這14個引物在羊鮑3個野生群體 90個個體中共檢測到72個位點。其中英州群體的多態位點數最多為65個,安游和亞龍灣群體的多態位點數則分別為61和62個。

表1 14個多態隨機引物的DNA序列及其擴增結果Tab.1 Sequences and amplification results of 14 random primers

圖1 引物S97對3個羊鮑野生群體的RAPD擴增圖譜Fig.1 RAPD amplification bands of three H.ovina stocks with primer S97

2.2 遺傳多樣性

羊鮑 3個野生群體的多態位點百分數(P)為84.72%～90.28%,平均為 87.04%;Shannon’s信息指數(I)為 0.400～0.456,平均為 0.433;Nei’s 基因多樣性指數(H)為0.262～0.305,平均為0.286 (詳見表2)。

2.3 遺傳分化與聚類分析

羊鮑3個野生群體間的遺傳距離(D)為0.0504～0.0731。其中英州群體與安游群體之間的遺傳距離最大為 0.0731,英州群體與亞龍灣群體的遺傳距離最小為 0.0504,而安游群體與亞龍灣群體的遺傳距離居中為 0.0577。群體間的遺傳分化系數(GST)為0.0976。根據各群體間的遺傳距離應用 NJ法得到 3個群體的聚類分析圖(圖2)。

表2 羊鮑3個群體的遺傳多樣性參數Tab.2 Indexes of genetic diversity of three H.ovina stocks by RAPD

圖2 用NJ法得到的羊鮑3個野生群體的聚類分析圖樹Fig.2 NJ cluster analysis dendrogram of three H.ovina stocks

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的核心與基礎,是生物種群內和種群間可遺傳的變異。種群遺傳變異的重要性在于它能夠使進化的變化得以發生,而這些變化的速率與現有的遺傳多樣性的數量成正比[17]。遺傳變異作為物種自身生存和未來進化的資源,不但能夠給種群帶來適合度方面的優勢,而且同樣有利于人工育種。多態位點百分數(P)、Shannon’s信息指數(I)、Nei’s基因多樣性指數是群體遺傳多樣性度量的主要參數。在本研究中,3個羊鮑野生群體的多態位點百分數(P)為 87.04%,Shannon’s信息指數(I)為0.433,Nei’s基因多樣性指數(H)為0.286。將此結果與同樣采用 RAPD技術所獲得的一些經濟貝類野生群體的遺傳多樣性參數均值進行比較,羊鮑群體的遺傳多樣性與文蛤(P= 86.5%,H=0.1935)[15]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(P= 85.46%,I=0.243)[18]、西施舌(Coelomactra antiquata)(P=78.97%,I=0.349,H=0.309)[19]等物種的遺傳多樣性相當;遠遠高于大珠母貝(Pinctada maxima)(P= 50.0%,I=0.1170)[20]、皺紋盤鮑(P=50.0%,I=0.258)[21]等物種的遺傳多樣性;而僅略低于青蛤(Cyclina sinensis)(P= 92.07%,I=0.558,H=0.377)[22]的遺傳多樣性。由此可以判斷,羊鮑在海洋經濟貝類中具有較高的遺傳多樣性水平,種質資源狀況良好。這一結論與采用 AFLP技術所獲得的研究結果一致[4]。根據以往的研究報道,在經過幾個世代的人工養殖后,物種的遺傳多樣性會有所降低[23-25],羊鮑雖為中國的經濟鮑類之一,但至今未開展大規模的人工養殖,這就避免了羊鮑養殖群體對野生群體的遺傳污染,從而間接地保護了羊鮑自然群體的遺傳多樣性。

Nei[26]認為群體間遺傳分化系數GST的值可以從0到1,當各群體間幾乎沒有分化時,GST的值接近0,因為各群體的所有等位基因頻率幾乎相同。在本研究中,羊鮑群體間的遺傳分化系數GST為0.0976,顯示其中90.24%的遺傳分化存在于群體之內,9.76%的遺傳分化存在于群體之間,因此羊鮑的群體內變異為主要變異,群體間的遺傳分化較小。遺傳距離是判斷遺傳變異的另一尺度。本研究的 3個羊鮑群體間的遺傳距離介于0.0504～0.0731之間,遠小于大珠母貝[20]、馬氏珠母貝[14]等物種群體間的遺傳距離,而與文蛤[15]、縊蟶[10]等物種群體間的遺傳距離相當。物種分化實際上是生物自身對異質化環境適應的結果。對于水產動物來說,發生遺傳分化的原因主要包括地理隔離與水文狀況差異以及人工干涉等[12-14]。具體到本研究的羊鮑群體來說,三個群體的采集地之間的地理距離較小,水文狀況差異不大。此外,雖然羊鮑為營附著生活的貝類,成體的活動范圍較小,但在羊鮑的生活史中,有營浮游生活的幼體階段,這就為群體之間發生基因交流創造了可能。劉必謙等[13]也認為,雖然對于貝類來說,基因流動的范圍是有限的,但由于進化是一個漫長的過程,在此過程中相距不遠的群體之間的基因也有可能慢慢擴散,從而降低了各群體間的遺傳差異。從本研究的聚類分析結果來看,英州群體與亞龍灣群體之間的親緣關系相對較近,而亞龍灣群體與安游群體之間的親緣關系相對較遠,這可能是由于安游群體與亞龍灣群體的采集地點都是較為封閉的海灣,從而在一定程度上阻礙了兩群體之間的基因交流所致。

一般認為,RAPD技術的多態性檢測程度要高于等位酶技術。這是因為從理論上講等位酶技術只能分析部分功能基因(外顯子)的情況,而對其余部分的基因無法分析,而 RAPD技術可以分析研究對象的整個基因組的情況,從而能夠獲得更多的遺傳信息。在本次采用RAPD技術的研究中3個羊鮑野生群體的多態位點百分數(84.72%～90.28%),遠高于采用等位酶技術獲得的 3個羊鮑野生群體的多態位點百分數(27.27%～54.55%)[2],這一比較結果再次驗證了上述理論。很多實驗證實,RAPD標記在單位分析中(每引物或引物對)檢測到的多態位點數顯著低于AFLP標記[27-28]。而從本研究中可以看出,優化較多數量的引物用于實驗檢測,便能獲得足夠的用于分析的分子標記,從而彌補 RAPD標記在該方面的不足。雖然影響RAPD反應的因素較多,但如果在實驗中采用標準化的反應條件,注重個體之間、群體之間實驗操作的同步性與對比性,保證DNA的提取、濃度檢測及PCR反應各成分的一致性和電泳條件的統一性,并通過多次重復反應,就可以獲得穩定而真實的實驗分析結果。此次 RAPD技術的分析結果與之前的 AFLP分析在羊鮑 3個群體的遺傳多樣性水平、群體間的遺傳分化程度的判斷及群體間的聚類分析結果等都顯示出高度的一致性[4]。由此不難看出,RAPD分析技術在遺傳學研究領域仍不失為一種簡便有效的分子標記。

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