基于MONTE－CARLO模型的細胞傳感器納米顆粒表面處理分析*

徐 瑩，韓 斌，徐銘恩，錢麗娟

(1.杭州電子科技大學自動化學院生物醫學工程及儀器研究所，杭州310018;2.浙江省腫瘤醫院腫瘤研究所，杭州310018)

隨著微加工工藝的發展，細胞傳感器和芯片的結合已經越來越緊密。目前比較常用的細胞傳感器主要有胞外電位檢測類器件如微電極陣列MEA(Microelectrode Arrays)［1］和場效應管(Field Effect Transistor，FET)［2］，阻抗測試儀 (Electric Cell-substrate Impedance Sensing，ECIS)等［3］。通常用于細胞電生理活動記錄的電極陣列是一個和細胞大小相匹配、具有獨立引線的金屬薄片圓盤陣列，當具有電興奮性或生理活性的細胞或組織培養于其上時，能感應胞外動作電位及其形態等生理參數的變化，將相關的電學參數輸出至外部系統。

表面處理是銜接細胞一級傳感和芯片二級傳感的關鍵。細胞與硅器件耦合的情況，直接影響測量信號的大小，尤其對于不太容易貼壁生長的神經細胞來說，有時信號甚至會淹沒在噪聲中。對于測試細胞動作電位的微電極陣列，更需繁瑣有效的表面處理過程，使細胞耦合并定位在電極有效區域，才具備二級傳感信號。電極表面處理的量化分析可用于說明器件和細胞耦合的難易程度［4］，但微電極在固體電極上伏安行為的重現性差，發生不重現的原因與固體電極的表面狀態直接有關:金屬表面具有一定的表面能，因在其晶體的棱面原子上具有未飽和的價態，這種表面能的分布不均勻。晶面上存在的缺陷，如臺階、紐結、螺旋錯位和吸附原子等，使溶液中的許多物質很容易吸附到這些具高能的點位上而造成污染。另一方面，金屬被化學或電化學的方法氧化。其表面產生氧化物膜(如鉑上的 PtO和PtO2)并吸附，容易形成惰化層。所以固體電極進行表面處理的第一步是進行機械研磨、拋光至鏡面程度［5－6］。

表面處理通常可分為幾個步驟。為提高微陣列的電學特性，通常對電極進行鉑黑納米粒子的電鍍，并在電生理測試前進行電化學測試，以避免鉑黑顆粒貼附性的退化。對于未使用過的鉑黑電極，其在1 mol/L H2SO4中的極化電容值為24 mF/cm2(采用伏安法對雙電層區域的測試結果，V=50 mV/s)，粗糙因子約為185，當使用后的電極參數明顯低于該參數時(5倍左右)，電極特性較差。之后，表面處理的生物素處理步驟可分為單分子或多分子層電極修飾，主要分為蘸涂、滴涂和旋涂法。這些方法均需通過化學物質的官能團來影響細胞和器件的有效貼附性。有研究者對培養神經元的基底進行化學和幾何改性，將某介質蛋白層粘素吸附在器件上，該器件表面易生長具特殊形態的海馬神經元，其主要依賴于層粘素單膜表面的化學特性［7］。所以生物素的有效作用位點也導致了器件處理的差異和不均勻性。因此，目前對于生物傳感器普遍要求電鍍鉑黑納米顆粒后再進行生物素的涂布，以提高表面處理的有效性。最后，細胞和電極的貼附需采用幾次清洗、再沉積過程才能達到各電極相對的穩定和一致的貼附程度。目前對于表面處理的效果還未有較直觀的理論仿真測試，只能采用電化學方法、光譜法、波譜法、QCM和顯微學等實驗方法等進行間接測試和直接觀察。

所以本文采用Monte-Carlo統計模型，判斷電極上電鍍鉑黑納米顆粒、貼附生物素膜后，電極表面均勻有機膜的上膜顆粒孔徑和有效程度等。由于將納米尺度的生物素涂覆到電極表面時，首先需要將生物素溶解充分后再滴至電極表面，該過程可等效為勻質顆粒隨機沉積到電極表面的過程，經攪拌均勻和清洗、再貼附的過程控制越精確，顆粒勻質程度越高，貼附程度越好。模型可定義一個有效表面貼附率C來判斷生物素貼附程度。根據模型的簡化程度，可分別假設沉積的納米顆粒為二維圓形和三維球形，微電極表面為圓盤結構;同時納米顆粒在電極上的貼附被認為是不可逆的，即一旦貼附上，不存在后期的脫附問題。

1 表面處理的相關仿真

1.1 單層貼附顆粒在電極上的分布

假設電極半徑R，考慮實驗中電極和表面處理的顆粒一般尺度大小，設半徑r，R＞100r，表面處理過程可等效為將鉑黑納米顆粒吸附到電極表面上。由于表面處理中同種顆粒的相互排斥性，若某粒子在貼附到電極的過程中，連續100次與電極上已貼附顆粒重疊(包括部分重疊)，則該次實驗結束，記錄此時的貼附率為C1，連續1 000次實驗后，將C1至C1000的分布進行統計得到分布圖曲線，判斷電極上納米顆粒貼附程度的有效貼附程度。

分析中，令圓盤金電極半徑R固定，沉積的鉑黑納米粒子半徑r動態變化，觀察粒子面積總和與電極面積比值的貼附率概率分布。實驗結束條件為某一欲沉積的納米粒子連續1 000次與已經在圓盤電極中貼附的納米粒子重疊。考慮一般微電極的尺度，實驗參數設置為:圓盤電極半徑R=12.5 μm;納米粒子在1個數量級內選取不同分散度，粒徑分別為 r=50，［50 100］，100，［100 150］，150，［150 200］，200，［50 200］(單位:nm)。

實驗結果如圖1所示。當納米粒子的半徑固定時，從概率分布圖上可以看出，隨著粒子半徑的增大，面積貼附率越大;但當粒子半徑增加到一定程度時，面積貼附率將穩定在某一范圍，不會隨著半徑的增大出現顯著的變化，如150 nm粒徑與200 nm單一粒徑的覆蓋率均在46%左右。同時，在實驗操作中，納米粒子的半徑是不固定的［4］。當符合均勻分布的粒子半徑分散度在某一區間范圍內，隨著區間范圍的增大，貼附率也增大，如粒徑散度為［50～200］nm的粒子貼附率提高至53%;但是，由實驗結果可看出，區間分散度相等情況下，粒徑越大，面積比反而減小，如貼附率結果為［50～100］nm＞［100～150］nm ＞［150～200］nm;同時，粒徑分散度越大，貼附率也越高，如［50～200］nm粒徑的面積覆蓋率達53%，且概率分布峰值也較顯著。所以，納米粒子的粒徑制備和淀積在達到實驗要求的基礎上，平均粒徑可適當減小，粒徑分散度可增大至一個數量級，從而達到較佳的電極總面積有效覆蓋率。

圖1 粒徑和分散度不同的單層貼附顆粒在圓盤電極上的貼附率分布

1.2 多層異質顆粒貼附有效性的仿真

在細胞微電極陣列的處理過程中，需要在鉑黑納米顆粒沉積后，再對電極陣列做多種生物膜的沉積處理，即在鉑黑等納米顆粒A沉積上后，在該部分上繼續沉積B生物膜，然后再進行一些靶向的生物量測試，實現一種“層層貼附”的處理方式。在此情況下，研究生物膜的有效覆蓋率具有必要性。為簡化計算，圓盤電極半徑仍固定為R，納米粒子A及生物膜顆粒B半徑RA、RB符合均勻分布，在A沉積于電極后，再淀積B顆粒，觀察B貼附率的分布曲線，即條件概率分布關系。其中S，圓盤電極面積;SA，圓盤電極中 A顆粒的面積和;SB－in，表示圓盤電極被A鋪滿后，A區域內B顆粒的面積和，比較A/B各面積覆蓋率的概率分布關系。為了計算的簡便，仍采用二維模型進行分析。

為說明實驗的有效重復性，圓盤電極半徑分別采用R=12.5 μm和35 μm進行比較。鉑黑粒子A粒徑 RA=50，［50 100］，100，［100 150］，150，［150 200］，200，［50 200］nm;考慮采用的統計模型及實驗中一般生物素的分子量和粒徑大小，該模型適用于具有較小粒徑的B顆粒，在實驗操作中，例如各種靶向生物病毒顆粒;取RB=［20～50］nm，在此條件下分析相關結果。考慮生物實驗中貼附的有效性，若A粒子連續1 000次與已沉積的A粒子重合;且B粒子連續1 000次與已沉積的B粒子重合，則實驗結束(圖2為實驗的直觀分布結果)。

圖2 簡化A粒子和B粒子為二維圓，當B粒徑小于A粒子時，B在A表面的淀積分布情況

圖3 A粒子貼附分布及B粒子在A內部的分布圖(單位:nm)

統計結果如圖3所示。其中，A粒子的貼附率分析同§1.1實驗結果一致;B粒子與A粒子的分布趨勢基本一致，即面積貼附率隨著A平均粒徑RA和其分散度的增大而增大，但面積比的概率分布峰形顯著程度明顯下降，即方差明顯增大。所以對于多層異質性顆粒，每一層的粒徑分散度越大，面積貼附率也越高，并且其貼附率遠大于該分布區間的單一粒子的粒徑最大值分布結果，但峰形顯著程度明顯下降，如粒徑分散度為［200～500］nm(貼附率概率分布峰值僅30%)與［100～150］nm(貼附率概率分布峰值達50%)的納米顆粒分布結果。另外，比較圖3(a)、3(b)的概率分布和面積覆蓋率情況，可見圓盤電極的大小對整體趨勢影響不大。所以當貼附多層生物素時，應綜合考慮貼附粒子的單一粒徑大小或均勻分布的粒徑分散度區間。當然，由于該二維統計方法的局限性和粒子粒徑的選擇范圍，具體的貼附率情況仍需進一步進行分析。

為進一步驗證A與B粒子的覆蓋率關系，還可采用逆向分析的方法參照分析。即A粒子貼附電極步驟完成后，判斷B粒子在A粒子以外的圓盤電極部分的覆蓋情況，然后與圖3的分析結果進行對比。實驗結果發現，對于單一粒徑分布或粒徑分散度不大的粒子，雖然由于統計方法不同，面積貼附率存在明顯區別，但概率分布峰形顯著程度變化趨勢與圖3基本一致，因此也可作為§1.2實驗結果的參照。然而對于均勻分布粒子，隨著粒徑及其分散度的增大，結果與圖3存在明顯不同。例如，在圖4中當A粒徑分散度分別為［100～500］nm、［200～500］nm、［300～500］nm 時，圖3、圖4的分布率結果相反，原因在于A粒子的分布不均勻性同樣能有效提高B粒子在圓盤電極其它區域的貼附程度，所以逆向分析結果也相反。因此該實驗結果作為對§1.2實驗的參照，適用于沉積的納米粒子粒徑和分散度均較小的情況。

圖4 電極半徑為12.5 μm時，A粒子貼附后的分布及B粒子在外區間的分布圖

1.3 三維異質納米顆粒貼附性的模型分析

在實際的實驗操作中，A和B均為三維的顆粒。例如，當在電極上電鍍鉑黑顆粒后，其三維結構的表面積總和應遠大于原圓盤電極表面積。由于統計A粒子的貼附率分布時，球體和圓形的模型計算結果差異不大，仍可采用§1.1實驗進行分析;而當多層粒子沉積時，例如B沉積在A粒子表面時，雖然可采用§1.1實驗來討論B粒子的貼附率分布區間和各貼附率曲線隨粒徑大小的大致變化趨勢，但具體數值則由于二維和三維的模型、及生物素A/B的粒徑不同存在較大差異。為更好說明實際操作中多層粒子分層貼附的情況，應將A和B均考慮為粒徑在相同分布區間的三維納米球型粒子進一步討論。由于實驗中各生物層粘素的主要成分為蛋白質，大小在60 kDa～150 kDa，同時各種納米粒子的粒徑大小一般在r=［50～200］nm左右，所以統一A和B的粒徑均為分散度為［50～200］nm的粒子。當A粒子貼附完成后，假設每個A粒子的有效貼附區域為上半球表面，對各個粒子根據表面積公式進行總求和運算，討論SA與S的關系;然后再分析球體B粒子在SA上的貼附率SB，最終說明SB貼附率變化。

實驗結束條件同§1.2，且B部分或全部與A接觸為有效貼附;實驗參數及方法設置為:圓盤電極R=12.5 μm;納米粒子 A 的半徑 RA=［50 ～200］nm;生物素B的半徑RB=［50～200］nm。

圖5 當納米粒子A貼附到圓盤電極后(a)，將納米粒子A以三維球體模型計算B粒子在A表面的分布(放大圖b)

當納米粒子A(RA=［50－200］nm)貼附到圓盤電極(R=12.5 μm)后，將納米粒子A以球體模型計算A貼附在圓盤電極上的分布，各A粒子上半球表面積之和SA與S之比，分布圖如圖5黑色點線所示，可見貼附在圓盤電極上的各種粒徑的A粒子表面積和比圓盤電極略有增大;考慮A粒子面積貼附率分布區間 p=［0.97～1.07］，可等價為一個面積為pS的新圓盤電極，計算生物素顆粒B(RB=［50～200］nm)在該等效電極的面積分布區間內重新貼附后，各B粒子分布曲線的統計估計值，得到最終分布圖如星形線所示。這可理解為當納米粒子存在后，生物素在圓盤電極上的表面處理結果(即B在A存在下的條件概率分布曲線)，結果發現，當B在A存在時，其表面貼附率穩定在51.5%左右;而A粒子貼附率的峰值也達到了52%(圖5右上圖，實線)，但達到該貼附率對應的概率分布最大峰值僅為40%，低于前者的60%，這說明多層處理后，圓盤電極表面處理的貼附率雖無明顯增大，但處理結果均一重復性提高，更易得到穩定的實驗結果并進行統計分析。另外，分析也進一步考慮了A/B納米粒徑分散跨度為一個數量級的區間分布，即［5～500］nm的顆粒，結果與圖5差異不大，說明納米粒子的分散度增加雖能增大后期處理的貼附率，但跨一個數量級以上的粒子分散度對有效貼附率提高作用不大。綜上，納米粒子(如鉑黑顆粒等)的電鍍貼附處理，能有效降低金電極表面的電極阻抗，增大多層生物素貼附的有效性，減小電極陣列間生物素處理的差異性，因此在電極上進行鉑黑處理是必要的，粒徑分散度可在一個數量級范圍內適當增大。

在實際操作中，生物素B并非一個個單獨的懸掛在納米粒子A上的，粒子間的縫隙、褶皺都可以增大B貼附的概率，而由實驗結果得出，A粒子的不均勻性更能增大B的堆積貼附率，這也是實驗中可采用鉑黑納米粒子電鍍于金圓盤電極上，提高表面處理的有效表面積、減小電極體阻抗的主要原因。

從§1.2實驗得出，若采用二維圓盤模型，當A粒徑為［50～200］nm，B粒徑［20～50］nm，B在 A粒子上貼附后，能達到的有效貼附度40%左右;而當A、B粒徑區間均取值［50～200］nm時，由于A、B粒徑處于同一分散度，不宜采用§1.2實驗方法，否則理論與實際的分析結果將存在更大差異。所以當多層貼附的粒徑A/B/C的粒徑差異不大時，為了分析準確性，應采用復雜度較高的三維粒子分析方法，而當多層貼附的粒徑及分散度均較小時，為了計算簡便程度，也可采用二維方法來討論多層粒子的有效貼附率分布隨粒徑分散度的變化。

2 電極電鍍及交流阻抗實驗

實驗采用了不同直徑、間距的圓盤電極陣列作為測試芯片進行了初步測試。以細胞阻抗電生理測試系統ECIS芯片［8－9］的設計進行改進，主要用途是根據陣列的實時電化學阻抗測試結果，分析細胞形態、細胞貼附等相對靜態參數;同時，其不同的陣列間距設計也可用于測試細胞的遷移及活性等動態參數。芯片各部分的布局如圖6所示。

圖6 基于微加工工藝的金圓盤電極照片(右上圖:單電極電鍍鉑黑后照片)

整個芯片面積大小為6 mm×3 mm。芯片各模塊共享參考電極。表1為圓盤電極各部分參數，共為4個具有微陣列點的金圓盤電極。其中圓盤電極1為單個直徑1.5 mm的金電極，用于細胞與電極貼附后的初步電生理阻抗測試;圓盤電極2直徑1 mm，陣列的單個電極點直徑為25 μm，和普通細胞大小10 μm～30 μm大小相匹配，主要用于測試貼壁性細胞的遷移及電生理活性等動態參數，圓盤電極3和4直徑均為1 mm，陣列點直徑和間距分別為100 um，250 um，等間隔排布，主要用于分析細胞形態、細胞貼附等相對靜態參數，并盡量減小相鄰電極之間的電場干擾問題。

表1 集成圓盤電極陣列芯片各模塊參數

為說明電鍍鉑黑粒子對圓盤電極表面積及阻抗的影響，對圓盤電極進行電鍍前后的交流阻抗比較試驗［10－11］。以直徑和間距最小的圓盤微陣列電極2為例(d=25 μm)，在 1 kHz時，阻抗值約為 500 kΩ，符合微電極能測到細胞阻抗電信號的要求，但會產生較大的熱噪聲，因此仍需要做表面處理，即采用電鍍鉑黑顆粒的方法，降低噪聲，平穩基線［12－13］。微電極陣列上的鉑黑沉積過程簡述如下:采用三電極法，電極浸泡在2%氯鉑酸水溶液中，控制電流密度為5 mA/cm2，圓盤電極為陰極;陽極為鉑電極，Ag/AgCl為參考電極。電鍍時，陽極和陰極需進行觀察并及時調整位置，以使得電化學過程在陰極表面電流分布均勻。沉積1 μm厚的(2 mg/cm2)多孔性鉑膜層，耗時需10 min。實驗條件控制在室溫下進行，可在沉積過程中添加攪拌子使貼附的顆粒更為均勻。沉積后，電極應迅速取出并用去離子水徹底清洗，以除去電鍍液。該電極可在去離子水中保存直至使用，也可在干燥器中充氮保存。如電極久置出現鈍化，可在新鮮熱硫酸溶液(體積比50%)中浸泡5s清洗后再使用，或重復電鍍。

圖7為電鍍前后，圓盤電極陣列2在0.9%的NaCl溶液中采用三電極電路對電鍍前后的電極交流阻抗圖進行比較(n=10，直流偏置－0.2 V，加載10 mV交流電壓)。在性能測試中，鉑黑顆粒使電極的阻抗幅值和相位均產生了一定的變化。電鍍前后，交流阻抗幅值基本下降一個數量級，幅值均隨著頻率的升高逐漸下降，但電鍍后低頻段內(1 Hz～100 Hz)阻值隨頻率變化的斜率無中高頻段變化顯著，所以針對阻抗幅值靈敏度的測試適合在中高頻段1 kHz～100 kHz進行;對于電鍍前后的電極相位，在1 kHz～10 kHz內，均為一基本恒定值(－80°左右)，因此可以判斷電極主要呈容性，測試靈敏度不高。但電鍍后低頻和高頻的相位隨頻率變化更明顯，所以在實際測試細胞貼壁阻抗時，為說明生物膜等有機物引起的電極表面容性阻抗的變化，10 kHz～100 kHz更適宜測試，且具有較好的靈敏度。因此，對電鍍前后的圓盤電極交流阻抗測試說明電鍍能有效增加電極表面積，從而改善電極的體阻抗及靈敏度。后期可針對電鍍后電極所培養細胞的不同，對于多種生物素在電極表面貼附率的實驗進行分析研究。

圖7 電鍍納米鉑黑顆粒前(a)后(b)的金圓盤電極交流阻抗圖比較

3 討論

本文針對圓盤金微電極陣列的表面處理貼附率有效性進行了Monte-Carlo三種分布模型的統計分析，在此基礎上開展相關的電鍍和交流阻抗實驗，從理論和實驗角度說明納米顆粒及其粒徑散度的表面處理對于生物微電極陣列的重要性，闡述了后期實驗的方向。目前細胞微電極陣列的普遍問題是相關電生理實驗缺乏可重復性，成為快速分析的瓶頸。所以對電極－細胞耦合程度的量化分析有助于后期實驗重現性、細胞與電極耦合有效性及細胞電生理信號特異識別性。表面處理技術的量化評估，有利于建立基于高通量平臺的實驗生物學、計算生物學、信息處理技術有機結合的研究方法，更易實現細胞芯片的便攜化和商品化，開拓食品、環境科學等相關應用領域［14－15］。

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