長(zhǎng)期使用氯米帕明對(duì)大鼠睡眠/覺(jué)醒及食欲素的影響

李德恒 王興紅 張志國(guó) 樊紅坤

睡眠紊亂是大多數(shù)抑郁癥患者的癥狀之一。有資料提示，運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒（動(dòng)物覺(jué)醒且處于活動(dòng)狀態(tài)）調(diào)節(jié)缺陷以及由此可能產(chǎn)生的代償性安靜覺(jué)醒（動(dòng)物覺(jué)醒且處于安靜狀態(tài)）增加，在抑郁癥的發(fā)病中可能起著重要作用[1]。

食欲素（orexin）系統(tǒng)是睡眠、攝食、內(nèi)分泌、消化、心血管活動(dòng)調(diào)節(jié)有關(guān)的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。食欲素系統(tǒng)包括食欲素A、食欲素B和食欲素1、2受體 (OX1R，OX2R)。食欲素能神經(jīng)元通過(guò)合成釋放食欲素A增加安靜覺(jué)醒，通過(guò)釋放食欲素B增加運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒。有研究發(fā)現(xiàn)，幼年使用氯米帕明處理的抑郁癥大鼠模型多個(gè)腦區(qū)的食欲素B明顯降低[2]。這些事實(shí)提示，抗抑郁治療很有可能影響食欲素的分泌并相應(yīng)地產(chǎn)生對(duì)覺(jué)醒與睡眠的調(diào)節(jié)。氯米帕明是一種三環(huán)類抗抑郁藥，并有很強(qiáng)的抑制快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠的作用，治療抑郁癥大多需要長(zhǎng)期服藥。我們前期的研究顯示短期使用氯米帕明可以減少運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒而增加安靜覺(jué)醒，并且影響食欲素的表達(dá)[3]。但是長(zhǎng)期使用氯米帕明對(duì)睡眠及食欲素表達(dá)的影響仍是未知的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

立體定位儀，日本Narishige公司；多導(dǎo)睡眠記錄儀，美國(guó)Grass Instrument公司；低溫高速離心機(jī)Avantim J-25型，德國(guó)Beckman公司；PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司生產(chǎn)；垂直電泳儀，Amersham Pharmacia Biotech公司；PE-480型凝膠圖像分析儀，法國(guó)Vilber Lourmat公司。

氯米帕明，美國(guó)sigma公司；RNAiso Reagent，aq Enzyme，AMV，寶生物工程(大連)有限公司；引物: 美國(guó)Invitrogen公司。

β-actin 編號(hào)：NM031144，全長(zhǎng)1296 bp，擴(kuò)增片斷427bp，序列5’-ATG AGG TAG TCT GTC AGG TC- 3’(650-631)；5’-GGT CAG AAG GAC TCC TAC GT-3’(223-242)。

Prepro-orexin 編號(hào)：AF041240，全長(zhǎng)577bp，擴(kuò)增片斷479bp，序列5’-TGG CTT TTT GAA CAA CAA CAG ACA TCT -3’ (25-51)；5’-GGA CAG GGC CCG AAG AAC GAC TCA -3’ (504-481)。OX1R 編號(hào)：NM001525，全長(zhǎng)1564bp，擴(kuò)增片斷188bp，序列5’-CCT TCC TGG CTG AAG TGA AG -3’ (998-1017)；5’-AGT GGG AGA AGG TGA AGC AG-3’ (1186-1167）。

OX2R 編號(hào)：NM001526，全長(zhǎng)1843bp，擴(kuò)增片斷200bp，序列5’-ACA TGG CAC CAC TGT GTC TC-3’（1019-1200）；5’-TGG CTC GGA TCT GCT TTA TT-3’（1219-1200）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)使用成年SD大鼠，雄性，體重（230±20）g（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。生理鹽水組8只；氯米帕明組8只。給藥方式為腹腔注射CLI 20mg/kg ， 注射生理鹽水0.1ml/20g。每12小時(shí)注射1次，共6周。于實(shí)驗(yàn)第5周實(shí)施多導(dǎo)睡眠描記電極安裝手術(shù)。術(shù)后第6天開(kāi)始睡眠描記。共描記96h睡眠/覺(jué)醒資料。描記期間動(dòng)物自由攝取水和食物，并處于光暗周期(12h:12h)條件下。在描記結(jié)束后2h斷頭處死全部大鼠，取額葉皮層、海馬和下丘腦，立即放置于液氮中，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3 RT-PCR

總RNA提取及RNA 反轉(zhuǎn)錄均按照試劑所明書(shū)進(jìn)行。PCR按下列組份配置PCR反應(yīng)液：TakaRa Taq 0.25μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)，MgCl2。 dNTP Mixture 4，模板DNA 2.5ng，引物1(1μL)，引物2(2μL)。MgCl2濃度為Prepro-orexin 2.0mmol/L，OX1R 2.2mmol/L，OX2R 2.1mmmol/L。反應(yīng)條件為Prepro-orexin，94℃3min，預(yù)變性，94℃30s ，59℃30s ，72℃40s，24個(gè)循環(huán)，72℃ 3min。OX1R 94 ℃3min，預(yù)變性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s，24個(gè)循環(huán)，72℃ 3min。OX2R94℃3min，預(yù)變性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s， 24個(gè)循環(huán)，72℃ 3min。β-actin 上述三條件都使用。產(chǎn)物凝膠電泳，凝膠照相，測(cè)定cpm值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，睡眠/覺(jué)醒記錄資料和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。睡眠/覺(jué)醒資料處理使用單因素方差分析，分子生物學(xué)資料結(jié)果使用t-test檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯米帕明對(duì)睡眠/覺(jué)醒周期的影響

覺(jué)醒狀態(tài)可以進(jìn)一步分為運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒和安靜覺(jué)醒。結(jié)果顯示和對(duì)照組相比氯米帕明注射，使得運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒時(shí)間減少，安靜覺(jué)醒時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。睡眠狀態(tài)也可以進(jìn)一步分為慢波睡眠和快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠。結(jié)果顯示氯米帕明使得快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠時(shí)間減少（P＜0.01），慢波睡眠時(shí)間增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 大鼠每日安靜覺(jué)醒和運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒的改變(min/D，)

表1 大鼠每日安靜覺(jué)醒和運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒的改變(min/D，)

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.01

表2 大鼠睡眠和覺(jué)醒時(shí)間的改變(min/D，)

表2 大鼠睡眠和覺(jué)醒時(shí)間的改變(min/D，)

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.05，** P＜0.01

組別 慢波睡眠時(shí)間 快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠時(shí)間生理鹽水組 696.16±52.14 158.23±13.38氯米帕明組 758.51±12.21* 98.54±8.45**

2.2 氯米帕明對(duì)食欲素系統(tǒng)mRNA的影響

腦內(nèi)食欲素前體mRNA在一定程度上反映了腦內(nèi)食欲素A、B的水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，注射氯米帕明使得額葉皮層、海馬、下丘腦的食欲素前體mRNA減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表3。同時(shí)食欲素2受體mRNA減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，見(jiàn)表4。但是上述腦區(qū)的食欲素1受體mRNA無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

表3 食欲素前體mRNA的表達(dá)（%，）

表3 食欲素前體mRNA的表達(dá)（%，）

注：與生理鹽水組相比， *P＜0.01

組別 額葉皮層cmp 海馬cmp 下丘腦cmp生理鹽水組 65.42±16.38 53.24±12.35 58.06±10.23氯米帕明組 18.05±6.03* 21.34±10.21* 13.25±3.28*

表4 食欲素2受體mRNA的表達(dá)（%，）

表4 食欲素2受體mRNA的表達(dá)（%，）

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 額葉皮層cmp 海馬cmp 下丘腦cmp生理鹽水組 63.54±31.02 50.23±7.36 72.56±22.31氯米帕明組 15.01±8.02* 14.98±8.23** 12.84±5.28**

3 討論

3.1 氯米帕明對(duì)睡眠/覺(jué)醒周期的影響

氯米帕明是一種經(jīng)典的三環(huán)類抗抑郁藥。它的藥理作用主要是抑制神經(jīng)末梢對(duì)5-羥色胺和去甲腎上腺素的重?cái)z取，從而延長(zhǎng)了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的作用時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用氯米帕明對(duì)快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠的抑制與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道的結(jié)果是一致的[4]。關(guān)于氯米帕明抑制快眼動(dòng)睡眠的機(jī)制尚無(wú)直接資料。有研究發(fā)現(xiàn)快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠的觸發(fā)和維持取決于腦干被蓋背外側(cè)核和腦腳橋核的膽堿能神經(jīng)元[5-6]。因此，氯米帕明對(duì)快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠的抑制機(jī)制可能是首先延長(zhǎng)了5-羥色胺和去甲腎上腺素的作用后，通過(guò)5-羥色胺和去甲腎上腺素受體抑制了膽堿能神經(jīng)元的活動(dòng)導(dǎo)致的。同時(shí)目前沒(méi)有證據(jù)證明氯米帕明對(duì)膽堿能系統(tǒng)有直接作用。

長(zhǎng)期使用氯米帕明抑制運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒，促進(jìn)安靜覺(jué)醒。這一結(jié)果與我們前期實(shí)驗(yàn)（短期使用氯米帕明）的結(jié)果是一致的[3]。氯米帕明對(duì)覺(jué)醒的影響是并不改變總覺(jué)醒時(shí)間。這一現(xiàn)象似乎不能以其對(duì)5-羥色胺和去甲腎上腺素重?cái)z取的抑制來(lái)解釋。因?yàn)檫@兩種遞質(zhì)都具有增加覺(jué)醒的作用。這些事實(shí)表明有可能氯米帕明同時(shí)激活了另一覺(jué)醒抑制性機(jī)制，保護(hù)了總的睡眠與覺(jué)醒的平衡。而這一機(jī)制可能與食欲素神經(jīng)元有關(guān)。

3.2 氯米帕明對(duì)食欲素系統(tǒng)三種mRNA 表達(dá)的影響

一系列證據(jù)表明食欲素和睡眠/覺(jué)醒調(diào)節(jié)有關(guān)[2，7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用氯米帕明顯著抑制了食欲素前體和食欲素2受體mRNA的表達(dá)，這種mRNA表達(dá)的抑制與氯米帕明所致的運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒減少是一致的。然而，導(dǎo)致這種結(jié)果的詳細(xì)機(jī)制尚無(wú)所知。現(xiàn)有資料提示兩種可能：一種可能是，首先氯米帕明抑制了5-羥色胺和去甲腎上腺素的重?cái)z取，延長(zhǎng)了這些遞質(zhì)的作用后；接著5-羥色胺和去甲腎上腺素反饋性地抑制了食欲素能神經(jīng)元或者食欲素前體的基因表達(dá)。但是這一解釋卻不能闡明氯米帕明對(duì)食欲素B受體mRNA的表達(dá)抑制。另一個(gè)可能是，氯米帕明對(duì)5-羥色胺和去甲腎上腺素重?cái)z取的抑制作用模擬了運(yùn)動(dòng)覺(jué)醒的分子生物學(xué)變化，而這一變化可能對(duì)食欲素B受體mRNA的表達(dá)具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。支持這一學(xué)說(shuō)的證據(jù)有5-羥色胺和食欲素B的釋放均是在肌肉運(yùn)動(dòng)時(shí)最高，5-羥色胺受體激動(dòng)劑抑制食欲素能神經(jīng)元的活動(dòng)[8]。盡管如此，對(duì)這一假說(shuō)的支持需要更多的直接資料。

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