高原肺動脈高壓大鼠重返平原后Caspase-3的表達

陳強 高芬

高原肺動脈高壓（high altitude pulmonary hypertension,HAPH）是指生活在海拔2500m以上地區的人群，因對高原環境適應不全所致低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）及相關臨床表現[1]。目前認為HPH的形成主要與低氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstricyion,HPV）和肺血管重建(pulmonary vascular remodeling, PVR)有關。有研究提示，在大鼠肺動脈高壓模型中，血管重建與凋亡密切相關[2-3]。我們通過測定高原肺動脈高壓大鼠、重返平原大鼠及對照組大鼠的肺組織caspase-3表達，探討重返平原對低氧性肺動脈高壓的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 雄性Wistar大鼠80只，體重180～220g,由甘肅中醫學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑 caspase-3兔抗大鼠IgG(美國abcam公司)；過氧辣根山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)；ECL顯色液（美國Pierce公司）;Marker（美國Fermentas公司）；其余試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 研究對象與分組

將80 大鼠隨機分為高原組（10、20、30d）、重返平原組（10、20、30、90d）、正常對照組，每組10只。所有大鼠用相同食物喂養,將高原組與重返平原組置于青海大學醫學院高原醫學中心低壓氧艙內,模仿海拔5000m高原低氧環境,進行22h/d低氧處理。于10、20和30d各取10只測定肺血流動力學指標與對照組比較，確定是否造模成功。30d后將高原低氧肺動脈高壓大鼠帶到海拔580m的陜西省咸陽市繼續喂養。

1.3.2 肺組織取材及保存

0.5%烏拉坦腹腔注射麻醉后經頸動脈放血處死，無菌迅速取出心肺組織，用生理鹽水沖洗干凈。沿肺門將心肺組織分離，并迅速將肺組織剪成直徑約5mm的小塊放入液氮速凍，然后放入凍存管，轉移至－80°冰箱保存。

1.3.3 Western blotting

（1）取肺組織約100mg，剪碎，加入0.5ml蛋白裂解液，手動勻漿至無組織塊殘留。(2)4℃離心，12000rpm，1min，取上清冰上孵育5min。(3)4℃離心，5000rpm，10min。取上清，即為蛋白提取液。(4)以BSA為標準品，用BCA法測蛋白濃度。(5)將樣品煮沸5min后進行SDS-PAGE蛋白電泳。(6)電轉至PVDF膜。（7）轉膜后用5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，用1:2500的caspase-3單抗（4℃過夜），第II抗體為過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 1:5000,室溫下孵育1h，最后用增強的化學發光試劑顯色，觀察結果。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 caspase-3蛋白質的表達

免疫印跡結果表明，高原組大鼠的caspase-3表達明顯低于正常對照組和重返平原后大鼠的caspase-3表達，結果見表1和圖1。

表1 各組大鼠caspase-3的表達（n=10，）

表1 各組大鼠caspase-3的表達（n=10，）

注：a P＜0.05 vs 對照組，b P ＜0.05 vs 高原20d，c P＜0.05 vs 高原30d，d P＜0.05 vs 對照組。

平原組10d 20d 30d 10d 20d 30d 90d 32.01±0.96 13.88±1.344 5.09±0.75a 6.07±0.90 6.89±0.81 10.53±0.43b 13.08±1.10c 22.30±0.43 d對照組 高原組

圖1 各組大鼠caspase-3的表達

3 討論

高原性肺動脈高壓是指正常人移居高原后由于低壓性缺氧，引起肺小動脈功能及器質性改變致使肺動脈壓力增高。早期高原性肺動脈高壓系因急性缺氧引起的肺小動脈收縮，長期慢性低氧則引起肺血管重構,最終發展為難治性梗阻性肺動脈高壓[4]。目前,有關低氧性肺血管重建發病機制的研究重點主要在細胞的增殖面。雖然肺血管平滑肌細胞增殖在低氧性肺血管重建中起至關重要的作用,但血管壁的構成是由細胞增殖和細胞凋亡之間的平衡所決定的,所以二者之間的平衡失調更為重要[5]。

天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspase）家族是參與肺血管平滑肌凋亡，抑制肺血管重構，阻止肺動脈高壓形成的凋亡因子。凋亡分子caspase-3，可啟動線粒體途徑和死亡受體途徑引起凋亡，是凋亡的最終執行者。我們發現，模擬高原20d后caspase-3的表達與正常對照組相比明顯減少（P＜0.05），這與肖雅瓊等[6]的實驗結果是一致的。重返平原20、30d 后caspase-3的表達較高原20、30d有所恢復（P＜0.05）,但是與正常組比較其表達仍低（P＜0.05）。由此可見，重返平原后，肺動脈高壓大鼠的凋亡機制逐步恢復，但未達到正常凋亡水平。可以推測，常氧常壓可造成低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管平滑肌caspase-3表達上調，增加凋亡，可以有效緩解高原低氧性肺動脈高壓。其具體作用機制及臨床應用有待進一步的研究。

[1]Ge Ri-Li,Peter Hackett.Life on the Qinghai-Tibetan plateau[M].Beijing: Peking University Medical Press,2007:100-110.

[2]Cho A, Court man DW,Langille BL.Apotosis(programmed cell death)in arteries of the neonatal lamb[J].Circ Res, 1995, 76: 168-175.

[3]Tuder RM, Marecki JC, Richter A, et al.Pathology of pulmonaryhypertension[J].Clin Chest Med, 2007,28: 23-42.

[4]張新川，張世界.慢性高原心臟病的的資料分析[J].當代醫學，2008,14（10）：88-89.

[5]鐘曉寧，姚龍.肺血管重建在低氧性肺動脈高壓中的作用及其機制[J].中國呼吸與危重監護雜志，2003（4）:246-248.

[6]肖雅瓊，肖詩亮,等.Dichloroacetate與肺動脈平滑肌細胞增殖及凋亡關系的研究[J].華中科技大學學報,2007,36（4）:482-484.