水蛭肽注射液對大鼠腦神經細胞凋亡的影響

閆珊珊

腦血管病是威脅人類健康的常見疾病之一，具有發病率高、死亡率高、致殘率高及復發率高的特點。缺血性腦血管病病理基礎與缺血后引起的神經元壞死和遲發性神經元死亡密切相關。其治療主要是溶栓、應用神經保護劑（包括谷氨酸拮抗劑、鈣通道阻滯劑等）、外科治療等。雖然取得了一定療效，但因缺乏滿意效果或安全性使其臨床應用受到限制。

水蛭肽注射液經初步研究顯示其具有抗血小板聚集和血栓形成的作用[1]，有研究表明水蛭肽注射液對腦缺血性腦損傷有明顯的保護作用[2]，可減輕腦水腫、改善腦組織學形態結構、改善腦能量代謝等，但水蛭肽注射液對神經細胞凋亡作用的研究尚未見報道。本研究從分子生物學角度出發，觀察不同劑量水蛭肽注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響，進一步探討水蛭肽注射液對腦缺血再灌注損傷的作用機制，為水蛭肽注射液治療缺血性腦血管疾病提供更可靠的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠60只，雌雄不限，體重250～320克，由廣西中醫學院實驗動物中心提供。飼養環境室溫25℃，空氣新鮮，動物自由飲水、攝食。

1.2 實驗藥物

水蛭肽注射液：每支2ml，（每ml含生藥1g）由廣西中醫學院第一附屬醫院制劑室制備，批準文號：桂衛藥制字（1998）005091.批號：031112-1。

1.3 實驗試劑

Hoechst33258細胞凋亡染色試劑盒（100x），由江蘇南通碧云天生物技術研究所購買，為Sigma公司產品。

TTC液，購自上海生物工程技術服務有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組法

把60只大鼠按照隨機、對照、均衡的原則，采用隨機數字表將大鼠分為5組，分別為假手術組，生理鹽水對照組，川芎嗪對照組，水蛭大、小劑量組，每組各12只。除假手術組外，其余四組均制備腦缺血再灌注損傷模型，生理鹽水對照組給予生理鹽水注射，假手術組在手術操作過程中，除不結扎頸總動脈外，其余處理方法同生理鹽水對照組。

2.2 實驗動物給藥方法

參照《中醫動物實驗方法學》的方法計算給藥，詳見表1。

2.3 大鼠大腦中動脈栓塞及再灌注模型的制備

60只健康Wistar大鼠，參照Nagasawa[3]栓線法并加以改進，阻塞大鼠大腦中動脈，制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術組做手術但栓線僅插入頸外動脈[4]。

2.4 標本采集

各組動物于腦缺血再灌注22h后，快速斷頭取腦，經視交叉吻端冠狀切開腦組織，制作腦部冠狀切片，片厚約4μm 。

2.5 缺血后神經功能評分

各組動物均栓塞左側MCA，缺血2h再灌注12h后，再次麻醉動物，麻醉前分別采用5分制進行神經功能評分[5]。

0級：正常；

Ⅰ級：右前爪不能完全伸展；

Ⅱ級：行走時向右側轉圈；

Ⅲ級：站立行走時向右跌倒；

Ⅳ級：無自發活動及意識水平下降。

2.6 神經細胞凋亡的檢測

2.6.1 腦組織神經細胞凋亡的形態觀察

采用Hoechst染色法[6-7]檢測神經細胞凋亡，具體方法如下：

腦缺血再灌注24h后，快速斷頭取腦，制作腦部冠狀切片，進行Hoechst染色。用熒光顯微鏡進行檢測，觀察神經細胞凋亡的形態。

2.6.2 大鼠腦組織神經細胞凋亡的百分率計算

選取Hoechst染色后的腦組織切片，在熒光顯微鏡下觀察大鼠腦組織，用顯微成像系統分析計算上述腦組織神經細胞凋亡的百分率。

2.7 統計方法

3 實驗結果

3.1 水蛭肽注射液對MCAO模型大鼠神經功能評分的影響

根據Zealonga的方法，將制作成大腦中動脈腦缺血再灌注（MCAO）模型的大鼠采用5分制進行神經功能評分。缺血前及再灌注損傷后給予水蛭肽注射液或川芎嗪腹腔注射的大鼠，其神經功能評分均能明顯降低（P＜0.01），水蛭肽注射液大小劑量組與川芎嗪組相比差異均有顯著性（P＜0.01，P＜0.05），但水蛭大劑量組的大鼠神經功能評分的大鼠神經功能評分與除假手術組之外的其余各組相比差異均有顯著性（P＜0.01）。各組大鼠神經功能評分詳見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分的比較（）

表1 各組大鼠神經功能評分的比較（）

3.2 水蛭肽注射液對MCAO模型大鼠腦神經細胞凋亡率的影響

3.2.1 Hoechst33258染色法檢測神經細胞凋亡時熒光顯微鏡觀察結果

經Hoechst33258染色法染色后，用熒光顯微鏡觀察，結果顯示，大腦皮質正常神經細胞與凋亡細胞均發出藍色熒光，但大腦正常組織細胞核呈彌散、微弱、均勻分布；而凋亡神經細胞的細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒凝快狀熒光及明顯核形態變化，發出強亮的熒光，如果在視野中見到3個或以上的DNA熒光碎片即可被認為是凋亡細胞。圖片可見生理鹽水對照組在腦缺血再灌注損傷22h后細胞凋亡數目明顯增加，水蛭大小劑量組和川芎嗪組在腦缺血再灌注損傷22h后細胞凋亡數目較生理鹽水對照組明顯減少。

3.3.2 各組大鼠腦神經細胞凋亡百分率的比較

腦缺血再灌注22h后，給予水蛭肽注射液或川芎嗪腹腔注射的大鼠，與生理鹽水對照組相比較，其腦神經細胞凋亡率均能明顯降低（P＜0.01），水蛭肽注射液大、小劑量組與川芎嗪組相比差異均有顯著性（P＜0.01），但水蛭大劑量組與水蛭小劑量組相比差異亦有顯著性（P＜0.01）。各組大鼠腦神經細胞凋亡率詳見表2。

表2 各組大鼠腦梗死面積百分比及左側大腦半球腦神經細胞凋亡百分率（）

表2 各組大鼠腦梗死面積百分比及左側大腦半球腦神經細胞凋亡百分率（）

4 討論

缺血性腦血管病屬中醫“中風”的范疇，隨著對中風病研究的不斷深入，中醫藥對中風發病機制及臨床治療效果均有所發展和進步。中醫治療缺血性中風常用的方法有活血化瘀法、化痰通絡法、益氣活血法、益腎通絡法、祛風通絡法、通腑瀉熱法、養陰活血法、清熱解毒法等[8]，但中醫認為中風的病機關鍵是瘀血，“瘀血不去，則出血不止，新血不生”，“凡血證總要以去瘀為要”，活血化瘀法是治療中風病的根本大法。

水蛭肽注射液是集多年臨床經驗研制而成的治療腦血管病的中藥制劑，經初步研究顯示其具有抗血小板聚集和血栓形成的作用，有研究表明水蛭肽注射液對腦缺血性腦損傷有明顯的保護作用[2]。具有減輕腦水腫、改善腦組織學形態結構、改善腦能量代謝等作用。

本實驗中采用線栓法阻斷MCA，方法更為簡單，對腦組織的直接損傷小，能阻斷豆紋動脈和其它直接從MCA發出的小皮層支，與臨床上腦梗塞發生的常見類型相似，便于制作腦缺血后再灌注動物模型；采用腦缺血2h后再灌注模仿臨床治療時間窗，更加符合臨床藥物治療研究實際。中醫認為“缺血性腦卒中”的病機關鍵是瘀血，治療應以活血化瘀為主，水蛭肽注射液可以活血化瘀，于MCA阻塞前3天，再灌注之始給予水蛭肽注射液，是模擬臨床上“預防窗”、“腦缺血超早期干預窗”而設計的，此時給藥可改善腦部微循環，抗血小板聚集，提高腦能量代謝，防止形成內結毒瘀的狀態，阻止其對缺血損傷的神經元產生不利作用。

本實驗結果表明，各實驗組缺血2小時后實行再灌注均存在神經細胞凋亡，但在量上存在明顯差異。假手術組可見少數細胞凋亡，這與其他研究結果基本一致，這可能是腦組織生長發育過程中一種生理性死亡及手術刺激引起的凋亡。生理鹽水對照組細胞凋亡發生率明顯增加，給予水蛭肽注射液后凋亡率顯著下降，水蛭小劑量組對神經細胞凋亡有一定的抑制作用，水蛭大劑量組可顯著抑制神經細胞的凋亡。說明水蛭肽注射液對腦缺血再灌注后神經細胞有明顯的保護作用，從而減輕腦缺血再灌注損傷。水蛭肽注射液抗細胞凋亡作用可能與清除氧自由基及促使凋亡抑制基因表達有關，但其抑制細胞凋亡的確切機制有待于進一步研究。

[1]王曉明,吳巖，邱智東,等.水蛭肽注射液對大鼠血小板凝聚及血栓形成的影響[J].中成藥,1998,20(4):27-28.

[2]董少龍,刁麗梅,竇維華.水蛭肽注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的防治作用及其機制[J].廣西中醫藥, 2004, 14(01): 47-50.

[3]Nagasawa H, Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke, 2001, 20: 1037.

[4]趙應敏,宋波,許予明.腦心通對缺血再灌注大鼠腦水腫的影響[J].當代醫學, 2009,15(16): 143-144.

[5]Zealonga E, Weinstein P R, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral attery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 2006, 20:84.

[6]胡野,凌志強,單小云.細胞分子醫學[J].軍事醫學科學出版社,2002,471-475.

[7]李曉軍,武建國.細胞凋亡檢測的研究進展及其與疾病的關系[J].臨床檢驗雜志,1999,17(1):53-56.

[8]劉亞敏,徐秋英.中醫藥治療缺血性中風的現狀[J].長春中醫學院學報,2002,18(2):57-58.