孕酮干預對缺氧缺血性腦損傷新生鼠腦組織膠質纖維酸性蛋白表達的影響*

王小引 李曉娟 李東亮 郭學鵬

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic en?cephalopathy，HIE）是由于圍產期缺氧缺血引起胎兒、新生兒的腦損傷所致，是引起兒童神經系統慢性傷殘的常見原因，已成為研究的熱點[1]。孕酮（progesterone）在缺氧缺血腦損傷（hypoxicischemic brain damage，HIBD）發病過程中起著保護腦組織的作用，可拮抗自由基的產生和抑制細胞凋亡等[2]，但這些研究多集中在神經細胞方面，對膠質細胞影響的研究不多，本實驗采用免疫組化和RT-PCR技術研究孕酮對新生鼠HIBD腦組織中膠質纖維酸性蛋白（gial fibrillary acidic protein，GFAP）表達的影響，旨在從分子水平探討孕酮對星形膠質細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡Wistar大鼠24只。雌雄不拘，體質量12～18 g，平均（14.58±3.29）g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。總RNA提取試劑盒和M-MLV逆轉錄酶購自Takara公司，引物均由上海生物工程有限公司合成。α-actin、GFAP一抗、即用型鏈霉親和素-生物素-酶復合物（strept avidin-biotin com?plex，SABC）免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物工程有限公司。

1.2 造模與分組 24只大鼠隨機分成3組，每組8只。假手術組平均體質量（14.06±1.36）g，僅分離左側頸總動脈，做頸部切口，不結扎，不做缺血缺氧處理；缺氧缺血組平均體質量（14.83±1.78）g，行缺氧缺血處理；藥物預防組平均體質量（14.90±1.67）g，行缺氧缺血處理且在缺氧前30 min按8 mg/kg腹腔注射濃度為0.5 g/L的孕酮溶液。各組間體質量比較差異無統計學意義（F=2.54，P＞0.05）。其中，缺氧缺血組和藥物預防組新生大鼠參照參考文獻[3]處理，用無水乙醚麻醉后，分離左側頸總動脈，絲線結扎，置于37℃恒溫的密閉容器中，以1.5 L/min通入80 mL/L氧氣和920 mL/L氮氣的混合氣體2.5 h，制備缺氧缺血動物模型。對模型制備后6 h內沒有出現向左側旋轉運動的動物給予剔除。本研究全部造模成功。

1.3 檢測指標 （1）免疫組化檢測各組腦組織GFAP的表達：缺氧缺血組和藥物預防組于HIBD后24 h處死，假手術組同時處死，迅速取腦，常規方法進行固定、脫水、透明、包埋、切片及烤片，GFAP免疫組織化學染色按試劑使用說明進行。GFAP蛋白表達陽性細胞的胞漿和胞核呈棕黃色，計數方法：在400倍光鏡下隨機計數皮質6個高倍視野，計數視野內GFAP染色陽性細胞，以平均值作為陽性細胞數。（2）RT-PCR檢測各組腦組織GFAP mRNA的表達：采用總RNA提取試劑盒從大鼠的腦組織中提取總RNA，并用Takara公司的逆轉錄試劑盒將其逆轉錄合成cDNA。PCR檢測GFAP mRNA的表達，β-actin為內參，上游引物5′-CGTTGACATCC GTAAAGACC-3′，下游引物5′-GCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3′，產物長度280 bp。GFAP上游引物5′-CGTTGACATCCGTA AAGACC-3′，下游引物5′-GCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3′，產物長度488bp。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，Bander leader 3.0凝膠圖像處理軟件進行灰度分析，GFAP與β-actin的產物條帶灰度值之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0進行統計學處理，計量資料數據用±s表示，成組設計的兩樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD-t法，方差不齊者采用Dunnett′ s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠GFAP表達的變化 假手術組GFAP陽性星形膠質細胞胞體瘦小且細胞數目很少，突起細短，散在分布；缺氧缺血組GFAP陽性星形膠質細胞胞體肥大、增粗、突起增多，細胞數目明顯增多；藥物預防組GFAP陽性星形膠質細胞也較多，胞體較大，突起較多，見圖1。

2.2 各組GFAP及GFAP mRNA表達的變化 GFAP mRNA及GFAP陽性細胞數在各組大鼠中的表達水平差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2、表1。

圖2 各組大鼠GFAP mRNA的表達

表1 各組大鼠GFAP及GFAP mRNA表達表達比較（±s）

表1 各組大鼠GFAP及GFAP mRNA表達表達比較（±s）

＊＊P＜0.01

組別 n GFAP陽性細胞（個）GFAP mRNA表達假手術組（1）缺氧缺血組（2）藥物預防組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）888 3.23±1.46 25.52±2.67 15.49±3.72 60.23＊＊＜0.001＜0.001 0.002 0.20±0.13 0.89±0.34 0.52±0.19 45.78＊＊＜0.001 0.004 0.005

3 討論

神經系統中，膠質細胞數量為神經細胞的10～50倍，其中星形膠質細胞（astrocyte，Ast）是中樞神經系統中主要的膠質細胞，約占腦總體積的50%，數量遠遠超過了神經元[4-5]。其在血管、室管膜、軟腦膜周圍形成一個“屏障”，將神經元與外界環境隔開，其胞質的突起也緊密地圍繞于突觸復合體及郎飛節周圍。Ast可調節細胞內外離子濃度、pH值、維持內環境的穩定、調節滲透壓、供應營養物質和代謝產物、形成和維持血腦屏障、清除氧自由基、攝取神經遞質、參與炎癥和免疫反應，具有吞噬、神經營養等方面的作用，在神經元發育過程中指導其遷移，調控突觸形成及突觸傳遞，并在神經元損傷后的可塑性和再生方面起著重要作用。腦缺氧缺血后，Ast的分布、形態和數量以及生物功能等方面都將發生變化[4-5]。

本研究結果顯示，腦缺氧缺血損傷后星形膠質細胞反應性增生，GFAP表達增加，與相關文獻報道一致[4]。腦缺氧缺血后，常誘發Ast激活并活化。Ast作為中樞神經系統缺血后第一個受損細胞，在腦缺血幾秒鐘后即開始肥大，隨著缺血的連續刺激，出現細胞形態學的改變，隨后出現細胞增殖，在梗死灶、梗死灶周圍出現大量反應性Ast，又稱為Ast的活化，活化的Ast一方面表現為胞體肥大，胞漿增多，嗜酸性，突起增粗、分支增多[5-6]；另一方面相關蛋白表達的增加，波形蛋白、GFAP是Ast的特異性標記物，在活化的Ast中顯著表達，常用來鑒別中樞神經系統中損傷區和未受損區的星形膠質反應性。其中GFAP為Ast特有的細胞骨架蛋白，在缺血缺氧后的反應性膠質細胞中尤為明顯，因此，GFAP被公認為Ast活化的一種特異性標志蛋白，GFAP增加意味著Ast的活化,活化的Ast可通過合成多種蛋白質、細胞因子對神經元起保護或毒性作用，對缺血性腦損傷的發展和轉歸具有重要意義[7]。一方面其自身分泌大量神經營養因子對腦組織損傷起著潛在的保護作用；另一方面亦可因過度增生形成膠質瘢痕，影響神經元的結構和功能的恢復，導致多種神經毒性作用產生。

目前有研究認為，腦損傷后星形膠質細胞GFAP表達增加，其早期以保護神經組織為主，晚期則以促進膠質瘢痕形成，阻礙神經再生為主[8]。本實驗中PT-PCR和免疫組化的研究結果提示，孕酮在缺氧缺血性腦損傷24 h后可能通過干預反應性Ast GFAP的表達，抑制Ast的過度活化、增生與腫脹以及隨之發生的Ast死亡。研究表明Ast的腫脹及死亡會造成血腦屏障功能的破壞[8]。本結果表明，孕酮可以明顯減少反應性Ast缺氧缺血24 h的增生程度，且Ast沒有過度活化，故其充分發揮了對細胞間液谷氨酸（Glu）的吸收和轉化以及K+的緩沖作用，減少了向細胞間液Glu的釋放；并抑制缺氧缺血后膠質細胞分泌一些對神經元及其他膠質細胞產生毒性作用的物質[5]，這可能就是孕酮對神經元保護作用的機制。因此，孕酮對于治療腦血管疾病有著良好的應用前景，對其神經保護作用及機制的研究，將為臨床上預防和治療缺血性腦血管病提供更有效的途徑。

[1]李新娟，韓華，田香勤.孕酮干預缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬葡萄糖轉運蛋白1、3基因的表達[J].實用兒科臨床雜志,2009, 24(14):1088-1089.

[2] Stein DG,Wright DW.Progesterone in the clinical treatment of acute traumatic brain injury[J].Expert Opin Investig Drugs,2010,19 (7):847-857.

[3]連俊蘭,余勤,王艷.幼年大鼠缺氧缺血性腦病動物模型的研究[J].現代中西醫結合雜志,2007,16(27):3947-3950.

[4]閆世軍,何曉明,李昕華,等.局灶性腦缺血預處理星形膠質細胞GFAP表達的變化[J].中國實驗診斷學,2009,13(10):1345-1346.

[5]楊慧，關永源.星型膠質細胞在腦缺血性疾病中的神經元保護機制[J].中國藥理學通報,2009,25(3):284-286.

[6]何璐,翟麗東,李云生.孕酮抗氧化作用對去卵巢小鼠學習記憶能力的影響[J].解剖學研究,2009,31(1):21-23

[7]Wang J,Jiang C,Li X,et al.The protective mechanism of progester?one on blood-brain barrier in cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull，2009,79(6):426-430.

[8]Coughlan T,Gibson C,Murphy S.Progesterone,BDNF and neuro?protection in the injured CNS[J].Int J Neurosci,2009,119(10): 1718-1740.