L-丙氨酸對INS-1E細胞胰島素分泌功能的影響

劉振平 申 晶 宋曉艷

糖尿病患者胰島素（insulin,INS）相對或絕對缺乏，使升血糖激素和降血糖激素之間的平衡被打亂，導致糖原合成下降，糖異生增加，血糖升高；脂肪合成減少，脂肪分解增加，游離脂肪酸增加；蛋白質合成減少，分解增加，氨基酸（amino acid,AA）代謝紊亂。L-丙氨酸是糖異生最主要的AA，也是肌肉蛋白質分解產生最多的AA之一。有動物研究表明L-丙氨酸在胰島B細胞中起著關鍵作用[1]。本文旨在探討L-丙氨酸對B細胞株INS-1E的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、牛血清白蛋白、N-2-羥乙哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）、L-丙氨酸及RPMI1640均購自Sigma公司；自行配制Krebs-Ringer緩沖液（主要成分115 mmol/L氯化鈉,4.7 mmol/L氯化鉀,1.28 mmol/L氯化鈣,5.0碳酸氫鈉,25 mmol/L HEPES，調至pH 7.4），INS-1E細胞由C.B.Wollheim教授（瑞士）饋贈。

1.2 細胞培養 INS-1E細胞在37°C培養箱、5%CO2中培養，培養液為改良的RPMI 1640（加有10%胎牛血清，11.1 mmol/L的葡萄糖，10 mmol/L的HEPES，100 IU/mL的青霉素，100 mg/L的鏈霉素，0.5%牛血清白蛋白），細胞在細頸瓶中貼壁生長，每周傳代1次。

1.3 實驗設計 為研究L-丙氨酸刺激INS-1E細胞分泌INS的劑量依賴性，分別對16.7 mmol/L葡萄糖加0、0.1、0.25、1、5、10及20 mmol/L的L-丙氨酸；為研究L-丙氨酸刺激INS分泌的葡萄糖依賴性，配制1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖2份，一份為葡萄糖組，另一份各加入10 mmol/L L-丙氨酸的條件做對照比較（葡萄糖+AA組）。

1.4 INS-1E細胞釋放胰島素 應用胰酶消化，培養液稀釋，離心收集INS-1E細胞，種植在24孔板中，每孔1 mL，2.5×105個細胞，37℃培養箱、5%CO2培養2 d，移出培養液，加入Krebs-Ringer緩沖液1 mL，37℃培養箱預培養30 min，移出緩沖液；每個孔中分別加入1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖或(和)10 mmol/L L-丙氨酸緩沖液。37℃培養箱培養1 h，從每孔吸取300 μL上清液，1 000 r/min離心2 min，取200 μL上清液-20℃保存待測。移出每孔中剩余的反應液，加入0.1 g/L氫氧化鈉1 mL放置30 min溶解細胞，充分混勻收集1 mL溶液，-20℃保存。

1.5 檢測指標 各實驗組均進行INS和蛋白質的測定。應用大鼠INS（Novo Nordisk）作標準，單125I標記的人INS(Novo Nordisk A/S)作示蹤劑，應用豚鼠抗豬INS抗體(Novo Nordisk, Bagsvaerd,Denmark)進行放射免疫測定胰島素，應用乙醇分離自由的和結合的放射活性，批內變異系數5%，批間變異系數10%。應用Bio-Rad公司的蛋白質測定試劑盒測定蛋白質以校正INS的含量。

1.6 統計學方法 應用GraphPad Prism 4.03軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間均數比較采用方差分析，2組間資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細胞分泌INS的劑量依賴性 隨著L-丙氨酸濃度的進行性增加，INS分泌呈增加趨勢，見表1。

表1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細胞分泌INS的劑量依賴性 （±s）

表1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細胞分泌INS的劑量依賴性 （±s）

＊P＜0.05

組別(丙氨酸+葡萄糖) n 胰島素/蛋白質（mg/g）0 mmol/L+16.7 mmol/L 0.1 mmol/L+16.7 mmol/L 0.25 mmol/L+16.7 mmol/L 1.0 mmol/L+16.7 mmol/L 5.0 mmol/L+16.7 mmol/L 10 mmol/L+16.7 mmol/L 20 mmol/L+16.7 mmol/L F 0.62±0.04 0.64±0.05 0.77±0.03 0.92±0.07 1.02±0.03 1.14±0.09 1.24±0.06 42.41＊12 12 12 12 12 12 12

2.2 丙氨酸刺激INS-1E細胞分泌胰島素的葡萄糖依賴性 與相應的單純葡萄糖組的比較，除1.1、3.3 mmol/L差異無統計學意義外（P＞0.05），其余各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。其中，葡萄糖組內在1.1～25 mmol/L葡萄糖范圍內，隨著葡萄糖濃度的增加，INS/蛋白質呈增強趨勢；葡萄糖+AA組內在1.1～11.1 mmol/L下，INS/蛋白質亦呈增強趨勢，見表2。

表2 10 mmol/L L-丙氨酸聯合葡萄糖刺激INS-1E細胞分泌胰島素與相應的單純葡萄糖組的比較［INS/蛋白質(mg/g)，n=20，±s］

表2 10 mmol/L L-丙氨酸聯合葡萄糖刺激INS-1E細胞分泌胰島素與相應的單純葡萄糖組的比較［INS/蛋白質(mg/g)，n=20，±s］

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 葡萄糖濃度（mmol/L）1.1 3.3 6.7 11.1 16.7 25葡萄糖組葡萄糖+AA組t 0.22±0.01 0.23±0.02 0.456 0.27±0.02 0.30±0.02 1.147 0.76±0.03 1.07±0.05 5.200＊＊0.85±0.04 1.28±0.07 5.616＊＊0.86±0.03 1.18±0.05 5.012＊＊0.93±0.04 1.35±0.07 5.170＊＊

3 討論

糖尿病患者持續存在著糖、脂肪及蛋白質的代謝紊亂。研究已經證實高血糖和高血脂對B細胞的急慢性作用[2]，而目前高氨基酸血癥對B細胞的急慢性作用研究報道尚少。本研究結果顯示，在16.7 mmol/L葡萄糖存在的情況下，隨著L-丙氨酸濃度的逐漸增加，INS-1E細胞分泌INS的量逐漸增加，表明了L-丙氨酸對B細胞分泌INS的急性刺激作用。10 mmol/L L-丙氨酸在6.7～25 mmol/L葡萄糖濃度范圍內促進葡萄糖誘導的INS-1E細胞的INS分泌，并且隨著葡萄糖濃度的增加，INS分泌量也顯示了逐漸增加的趨勢。但在1.1、3.3 mmol/L葡萄糖存在的條件下，10 mmol/L L-丙氨酸未促進葡萄糖誘導的INS-1E細胞的INS分泌，提示L-丙氨酸促進INS分泌的作用依賴于一定水平葡萄糖的存在。

Brennan等[3]研究證實L-丙氨酸經與鈉離子共同轉運進入B細胞，經鈉離子內流、胞漿膜去極化、電壓依賴的鈣通道開放及鈣離子內流，觸發INS胞吐作用。進一步研究發現，L-丙氨酸經鈉離子共同轉運誘發INS分泌僅占其促INS分泌作用的10%～20%，而經氧化磷酸化代謝產生三磷酸腺苷（ATP），使ATP/二磷酸腺苷（ADP）比值升高，致使ATP敏感的鉀通道關閉，胞漿膜去極化，電壓依賴的鈣通道開放，鈣離子內流，觸發INS胞吐作用；直接證據是呼吸鏈毒素寡霉素顯著地降低了L-丙氨酸刺激的克隆B細胞的INS分泌[3]。本研究結果亦顯示L-丙氨酸促進INS分泌，并且證實其促INS分泌作用依賴于一定的葡萄糖水平，考慮原因為丙氨酸的攝取依賴于葡萄糖氧化磷酸化產生的ATP。正常人血漿中L-丙氨酸含量在0.5 mmol/L左右，本研究結果顯示在16.7 mmol/L葡萄糖存在的條件下，0.25 mmol/L L-丙氨酸誘導的INS釋放高于單純16.7 mmol/L葡萄糖，提示L-丙氨酸可能參與了糖尿病高血糖狀態下INS分泌的調節。

有研究認為L-丙氨酸促進了B細胞內葡萄糖的代謝，L-丙氨酸與鈉離子共同轉運致使胞漿內Ca2+增加，Ca2+活化丙酮酸脫氫酶，則來源于葡萄糖的丙酮酸代謝增加[3]；而葡萄糖代謝產生的ATP也促進L-丙氨酸的攝取和利用[1]。本研究結果顯示，10 mmol/L L-丙氨酸和1.1、3.3 mmol/L葡萄糖誘導的INS分泌與單純1.1、3.3 mmol/L葡萄糖誘導的INS分泌的差異無統計學意義。然而，10 mmol/L L-丙氨酸+3.3 mmol/L葡萄糖誘導的INS分泌較10 mmol/L L-丙氨酸、1.1 mmol/L葡萄糖誘導的INS分泌顯著增加，提示L-丙氨酸與葡萄糖之間可能有協同作用。有研究指出，B細胞線粒體內谷氨酸濃度是葡萄糖誘導的INS胞吐分泌的遞質[4]，并認為L-丙氨酸經代謝為谷氨酸進而促進INS釋放[5]。但需要更進一步研究以確認L-丙氨酸在糖尿病高血糖環境下對胰島B細胞分泌INS的急慢性作用。

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