內源性Phb2在HeLa細胞中表達和定位

趙艷明，張 強

Phb(2prohibitin 2，37kD)是細胞的一種結構高度保守，分布廣泛，表達豐富的膜蛋白家族成員，同時它也是一種多功能蛋白質，參與細胞的多種生命活動［1］，其基因cDNA序列全長900個堿基對，編碼299個氨基酸殘基的phb2蛋白，蛋白質結構中含有一個保守的PHB結構域(PHB domain)，一個預測的螺旋區域(coiled-coil region)［2］。研究顯示phb2參與細胞周期調節［3］，細胞生存［4］，轉錄調節［5］，調節姐妹染色單體的結合［6］，信號轉導［1］等多種過程。為了進一步探討人的phb2蛋白的功能，我們檢測了Phb2蛋白在HeLa細胞內的表達與分布情況，對phb2在細胞內的表達和定位進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞:HeLa細胞購自北京生物科技發展有限公司。主要試劑:DMEM培養基(Gibco產品);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);FLAG一抗(SIGMA公司);ECL顯色試劑盒(Pierce公司);其它試劑為國產分析純或符合實驗要求。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hela細胞以1×105～2×105/cm2的密度種入加入了DMEM的60 mm的培養皿(在定位實驗中，培養皿預先放入了多聚賴氨酸浸泡過的蓋玻片)37℃，5%CO2培養，并定期換液。

1.2.2 Western-Blot檢測 待細胞長滿后，收獲細胞，提取Hela細胞蛋白樣品，加入2×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min和標準蛋白Marker一起進行SDS-PAGE電泳，100 V轉膜2 h，5%的脫脂奶粉封閉1 h，之后與FLAG一抗過夜孵育 (稀釋倍數1:500)，TBST洗膜后與二抗(山羊抗小鼠，稀釋倍數1:8000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后于暗室加ECL試劑檢測，X線片曝光并顯影和定影。

1.2.3 熒光觀察 Hela細胞接種到經多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，24 h后待細胞長到20% ～30%的匯合度時。用預冷PBS溶液洗3遍。－20℃預冷的甲醇固定2 min，棄甲醇。70%乙醇洗5 min，棄乙醇，PBS溶液洗5 min，棄PBS。1%的脫脂奶粉封閉0.5 h，棄封閉液。加FLAG一抗(稀釋倍數1:200)室溫孵育2 h，回收一抗，封閉液洗3次，每次5 min。加羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG(稀釋倍數1:500)室溫孵育1 h，棄二抗，用PBS溶液洗3次，每次5 min。加0.15 g/L DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma)溶液，室溫 2 min，棄DAPI溶液。用PBS溶液洗3次，每次5 min，用濾紙盡可能去除蓋玻片上的溶液，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上。4℃儲存過夜后用熒光顯微鏡(Olympus，BX61型)觀察并拍照。

2 結果

2.1 phb2蛋白在HeLa細胞中的表達 SDS-PAGE電泳，X線片曝光并顯影和定影，Hela細胞裂解液檢測到約37 ku大小的條帶，與phb2蛋白的分子量37 ku相符，見圖1。

圖1 Western-Blot檢測phb2蛋白表達

2.2 phb2蛋白在HeLa細胞的定位 見圖2。

3 討論

人phb2蛋白最初作為與鼠的B淋巴細胞的IgM受體相互作用蛋白而被Terashima等發現，因此，將其命名為BAP37(B-cell-receptor complex-associated protein)［1］。Phb2 蛋白是一種在真核細胞中廣泛表達并且在進化過程中高度保守的蛋白。其氨基端有一段疏水區域，該區域把phb2錨定在膜上;其余的部份位于膜間隙。羧基端含有一個所謂的PHB結構域和一個預測的螺旋區域(coiled-coil region)，該區域在酵母細胞中參與PHB蛋白復合物的組裝［2］。

圖2 phb2蛋白在HeLa cell細胞中的定位

人的phb2位于常染色體12p13，它屬于PHB家族，家族中的另一個成員是phb1。phb2與phb1是親密的關聯蛋白并且在酵母、植物，蠕蟲、蒼蠅、哺乳動物這些物種中是高度保守的［7］。有研究表明，phb2蛋白的氨基端有一段 MTS(mitochondrial targeting sequence)，該序列使phb2能定位在線粒體上，同時，phb2也可以借助其羧基端的結構域使phb2定位于細胞核內［7］。phb2定位于核內，這與phb2具有的對轉錄因子的轉錄活性的調節是一致的。這種調節通過與轉錄因子直接結合，或是與染色質重塑蛋白結合這種方式調節轉錄，如:對類固醇激素受體的調節［8］。然而使人不解的是，phb2的核定位僅在一些細胞系有報道，這些細胞系主要來自于乳腺癌和前列腺癌［9］。本研究利用進行Western-Blot及免疫細胞熒光法等來確定phb2蛋白在HeLa細胞中的表達和定位，雖然在細胞中沒有探測到phb2的核定位，但這并不能說明phb2就不在這些細胞中發揮轉錄調節功能。而研究phb2蛋白在Hela細胞中的定位是研究蛋白質功能的一個重要的方法，通過細胞內的定位，可提示蛋白質可能的功能及發揮功能的可能方式。從而為蛋白質功能的研究提供了方向及相應方法。

本文報道了人phb2蛋白在HeLa細胞內主要在胞質內表達，并且以核周分布為主，細胞核中未見到明顯的表達(圖2)，可見phb2蛋白在HeLa細胞內主要在胞質內表達，并且以核周分布為主，細胞核中未見到明顯的表達。關于phb2蛋白在HeLa細胞內的亞細胞定位，還需要做大量的工作和探索。本實驗只是對人Phb2蛋白在HeLa細胞中表達和定位進行初步的探討，對于phb2蛋白的亞細胞器定位及相應功能，我們將在以后的工作中進一步探討。

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