含HN基因的重組雞痘病毒抑制骨肉瘤細胞SAOS-2的體外實驗研究

張治宇,苑福升,李力卓,胡 碩,孔大亮,高志學

（1.中國醫科大學附屬第四醫院骨科,遼寧沈陽110031;2.中國醫科大學附屬盛京醫院骨科;3.第二軍醫大學長海醫院骨科;4.吉林大學中日聯誼醫院;5.中國醫科大學北京順義醫院骨科）

應用分子生物學技術手段研發的新型抑癌基因、細胞因子、轉染病毒等的抗腫瘤制劑已成為繼手術、化療、放療之后最具有應用前景的腫瘤治療方法[1,2]。雞痘病毒基因組龐大,不僅可以有效的感染哺乳動物細胞,在哺乳動物細胞中表達早期基因,而且重要的是其不在感染的宿主細胞內表達具有感染性的病毒粒子[3-5],本文檢測了以為雞痘病毒載體構建的含HN基因的重組雞痘病毒對腫瘤細胞SAOS-2的體外抑瘤效應。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

含HN基因的重組雞痘病毒（rFPVHN）由解放軍軍事醫學科學院11所構建并保存;SAOS-2腫瘤細胞由第二軍醫大學長海醫院骨科實驗室保存;Rhodamine123購自寶生物公司;MTT購自SIGMA公司;流式細胞儀BD FACSAria為DB公司產品;酶標儀Takara公司產品;1640培養基購自寶生物公司。

1.2 MTT染色法檢測殺傷率

消化處于對數生長期的SAOS-2腫瘤細胞,計數（1×104個/孔）后培養于96孔細胞培養板,37℃,5%CO2條件下,培養至細胞貼壁生長。用無血清無雙抗的 RPM I1640稀釋FPV及vFV 3,以100MOI感染SAOS-2腫瘤細胞,2 h后補加完全的營養液（10%FBSRPMI1640）,分別于感染后 24、48、72 和 96 h,加入20μlMTT溶液（5mg/ml,溶于PBS中,經0.22μm濾器過濾除菌）,37℃,5%CO2繼續培養4 h后,吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μl DMSO,振蕩10 min。應用酶標儀,于490 nm處檢測各孔A值,并按以下公式計算殺傷率。

1.3 流式細胞儀分析檢測細胞線粒體膜電位

消化處于對數生長期的HCT-8細胞接種于6孔細胞培養板中（2×105個/孔）,細胞貼壁后,以100 moi的 rFPVHN感染,37℃、5%CO2培養 2小時后補加完全的營養液。于感染后72 h后收集細胞,棄上清,PBS洗2次后重懸于300μl PBS中,加2μl 20 mg/m l Rhodamine123,避光室溫放置0.5小時,PBS洗2次,流式細胞儀分析檢測細胞線粒體膜電位。

1.4 含HN的重組雞痘病毒轉染腫瘤細胞后唾液酸含量的測定

收集轉染72 h的OS732細胞,PBS洗2次,用100μl重蒸水重懸細胞,冰浴中用超聲波細胞破碎儀制備細胞樣品,按文獻[6]的方法進行唾液酸含量的測定。在721紫外分光光度計,560 nm處測定唾液酸的A560值,取其平均值。

1.5 Caspase-3活性測定

250 g離心5min收集 2×106-5×106個細胞,用pH7.2的冷PBS洗1次,用200溶解緩沖液重懸。冰上孵育細胞30min。13 000 r/min離心5min,取上清做蛋白定量并進行Caspase-3活性測定。在水或DMSO中溶解底物DEVD-pNA或YVAD-pNA,配置成20mmol/L的儲存液,-20℃避光保存。在100μg-500μg蛋白抽提物中底物濃度160-200μmmol/L,終體積50-100。將反應混合液置微量滴定板中,用微量滴定板分析儀在405 nm濾光片下讀取反應數據。

1.6 統計學處理

統計學處理采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 MTT法檢測SAOS-2細胞死亡率

MTT法檢測結果表明在感染量一定的條件下,隨著作用時間的延長,rFPVHN致SAOS-2腫瘤細胞的死亡率也有所升高,在72 h達到峰值,繼而下降（圖1）。隨著感染量的增高,在相同的作用時間內,rFPVHN致SAOS-2 SAOS-2細胞的死亡率均有所升高,但并不形成嚴格的劑量效應關系。以上結果表明重組病毒感染SAOS-2腫瘤細胞72 h后可最大限度地殺傷SAOS-2。

2.2 Rhodam ine123結合FACS檢測線粒體功能

SAOS-2腫瘤細胞感染rFPVHN 72 h,SAOS-2線粒體吸附Rhodamine123的能力下降,流式細胞儀檢測與正常SAOS-2腫瘤細胞及FPV感染的SAOS-2腫瘤細胞相比,被rFPVHN感染的SAOS-2腫瘤細胞峰向左移（圖2）,說明rFPVHN的感染導致SAOS-2腫瘤細胞線粒體膜電位下降。

2.3 rFPVHN感染SAOS-2細胞后唾液酸含量的測定

從表1看,rFPVHN組血清唾液酸含量最低。這說明HN基因在體內發揮了神經氨酸酶的作用,顯著降低了血清中唾液酸的含量。

圖1 FPVHN致SAOS-2腫瘤細胞死亡率

圖2 SAOS-2腫瘤細胞感染rFPVHN后線粒體吸附能力變化

表1 Sialic acid contents of infected SAOS-2 cells

2.4 Caspase-3活性測定

rFPVHN轉染SAOS-2腫瘤細胞72 h后提取SAOS-2腫瘤細胞細胞漿蛋白質,利用特異性發色底物檢測Caspase-3活性。從D值結果可以看出,rFPVHN轉染SAOS-2腫瘤細胞72 h后激活了Caspase-3（圖3）。

圖3 rFPVHN轉染SAOS-2腫瘤細胞后Caspase-3活性變化

3 討論

骨肉瘤惡性度大,發病率高,轉移較早,致殘率高,好發于青少年和年輕成人,是惡性骨腫瘤中具有代表性的腫瘤,80%的骨肉瘤患者在確診時已經在體內產生微小的轉移灶。近年來隨著新輔助化療技術及隨之開展的保肢技術在臨床上的廣泛應用,不僅僅使患者免受截肢之苦,患肢肢體功能明顯改善,而且患者的5年生存率較20年以前有了顯著的提

高[1-2]

。可是這并不能掩蓋新輔助化療及保肢治療技術手術的局限性和其缺點,既新輔助化療及手術治療都是立足于直接殺傷腫瘤細胞,雖然殺滅了大多數腫瘤細胞,但是使正常組織受到同樣的傷害,重要的是無法作到徹底消滅腫瘤細胞及微小的轉移灶。

本研究中,測得rFPVHN可以導致SAOS-2細胞表面唾液酸明顯減低。證明新城疫病毒HN基因表達產物HN蛋白的神經氨酸酶活性使其水解了SAOS-2腫瘤細胞表面的唾液酸,使SAOS-2腫瘤細胞表面抗原暴露于機體強大的免疫系統,增強了免疫系統對SAOS-2腫瘤細胞的識別和殺傷,這和相關研究表明新城疫病毒HN蛋白可以水解腫瘤細胞表面唾液酸,在一定程度上抑制了腫瘤細胞的免疫逃避[7]是一致的。

另外MTT法檢測結果表明。在感染量一定的條件下,隨著作用時間的延長,rFPVHN致SAOS-2腫瘤細胞的死亡率也有所升高,在72 h達到峰值,繼而下降。流式細胞儀檢測被rFPVHN感染的SAOS-2腫瘤細胞線粒體膜電位下降,72h后激活了Caspase-3。這說明在體外實驗中,含HN基因的重組雞痘病毒可以導致骨肉瘤細胞SAOS-2凋亡,其可能是通過線粒體途徑誘導骨肉瘤細胞SAOS-2細胞凋亡,至于骨肉瘤細胞SAOS-2確切的凋亡機制還需要進一步更深層次研究。

[1]Witting JC,Bickels J,Priebat D,et al.Osteosarcoma:amultidisciplinary approach to diagnosis and treatment[J].American Fam ily Physician,2002,65:1123.

[2]蔡猷伯,孫宇慶.骨肉瘤診斷與治療的進展[J].癌癥進展雜志,2005,7（3）:309.

[3]Reichard KW,Lorence RM,Cassino CJ,et al.Selective replication of Newcastle diseasevirus（NDV）in cancer cells isassociated with virus-induced cell fusion[J].Proc Am Assoc Cancer Res,1992,33:521.

[4]米志強,金寧一,龔 偉等.新城疫病毒HN基因構建的核酸疫苗抗腫瘤作用研究[J].中國腫瘤生物治療雜志,2003,10:93.

[5]金寧一,米志強,龔 偉.新城疫病毒HN基因與雞貧血病病毒VP3基因對小鼠黑色素瘤的聯合抑制效應[J].中國獸醫學報,2003,3,23（2）:127.

[6]曹興建,王逸民.3,5二羥基甲苯測定血清唾液酸[J].臨床檢驗雜志,1998,16（3）:53.

[7]Schirramacher V,HassC,Bonifer R,et al.Human tumor cellmodification by virus infection:an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory propertieswhen using Newcastle disease virus[J].Gene Ther,1999,6:63.